1、基于紫外-可见- 近红外光谱技术的蔬菜细胞 ATP 含量无损检测研究摘要：农产品细胞内的 ATP 含量水平直接反映细胞的活性，在产后贮藏过程中可作为农产品新鲜度和品质的一种评价指标。采用紫外-可见-近红外分光光度计 UV-3600 获取菠菜叶片样本的光谱数据，并采用常规物理化学方法和萤火虫荧光素酶生物发光技术制备和测定细胞原生质体悬浮液及其细胞原生质体的ATP 含量。利用 person 相关分析确定关键特征波长，并建立基于 298 nm 紫外光和 730n,近红外光两个特征波长菠菜叶片光谱反射率的细胞原生质体 ATP 含量的预测模型。结果分析表明，298 m 紫外光和 730 nrn 近红外光
2、两个特征波长具有预测细胞原生质体 ATP 含量的潜力(R 2=0.802 9 和 0.901)。提出的基于光谱技术的蔬菜细胞 ATP 含量检测方法为准确、快速、无损的蔬菜新鲜度评价提供一种新的技术途径。关键词蔬菜；ATP；光谱技术；预测模型；新鲜度评价1 实验部分1.1 材料研究选用从市场购得的叶类蔬菜菠菜(Spinacia oleracea)为试验材料。样品置于丙烯酸室内，在恒温培养箱内保存。恒温箱设定温度为 25，贮藏时间为5 d。实验期间，恒温箱每天(24 h)定时通风一次。每 24 h 定时取样一次，选取完整叶片 34 片。1.2 仪器与光谱数据采集采用赛默飞世尔（thermofish
3、er ） 紫外分光光度计 Evolution 300 获取菠菜叶片样本的光谱数据，其波长范围为 2402 400 nm。选取叶片上 4 个点，分别测定各点的光谱数据。用 Evolution 300 附带的软件系统分析获得测定叶片的光谱反射率，并计算其平均值。1.3 叶片原生质体的制备取经光谱数据测定后的相同菠菜叶片，无菌水洗涤 45 次，用镊子剥去叶片的表皮，将去除表皮的叶片切成 0.51cm 大小的薄片后，置于酶溶液(0.5 mol/L 甘露醇，1纤维素酶 R-10(Yakult Honsha Co)，0.2离析酶的 R-10(Yakult Honsha Co)中浸泡，并放置于 25的恒温培
4、养箱内酶解 3 h。用孔径为 70um 的尼龙网过滤除去未完全消化的残渣。在 900 rmin 叫条件下离心2 min，弃上清。加入 3 4 mL 0.5 mol/L 甘露醇洗液，相同条件下离心 2 min，弃上清，留 1 mL 洗液。重复以上离心清洗 3 次，获得含有活力强且状态好的原生质体悬浮液。1.4 细胞原生质体 ATP 含量的生物发光测定采用萤火虫荧光素酶生物发光技术测定上一步骤制备的细胞原生质体的ATP 含量。准确获得原生质体的平均 ATP 含量，首先取原生质体悬浮液 2uL，用 Leica DFC 320 显微数码摄像机对悬浮液中原生质体数量进行计数。然后根据悬浮液中细胞原生质体
5、的数量，选择一定的稀释比例制备测试样品。用萤火虫荧光素酶的检测试剂盒(Toyo B-NetCo ，Ltd ，Japan)和光度计测量仪(LuminescencerPSN 腽 2200-R，Atto Corporation，Japan)测定相对发光量(RLU)并计算总 ATP 含量。根据悬浮液中细胞原生质体的计数结果，获得悬浮液中单个细胞原生质体的平均 ATP 含量。1.5 数据分析、预测模型的建立与评价用 Excel 2003 软件对获得的光谱数据和细胞原生质 ATP 含量进行统计分析，采用 Person 相关系数评价相关程度，确定预测原生质体 ATP 含量的最优特征波长。在此基础上，将实验数
6、据平均分割成建模数据集和验证数据集两个部分。前者用于建立基于最优特征波长光谱数据的细胞原生质 ATP 含量预测模型，后者用于对所建模型的预测效果进行验证和评价。2 结果与分析2.1 贮藏期间叶片光谱数据的变化菠菜叶片光谱数据在贮藏期间的变化动态如图 1 所示。由图可见，不同贮藏时问获得的光谱数据呈现一致的光谱变化特征：紫外光范围光谱反射率较低，可见光范围绿色光波长反射率较高，近红外 7001 300 nm 波长范围达到最大的反射率，之后迅速下降至 1 440 nrn 的低谷，1 650 和 2 220nlTl 附近又出现 2个峰值。不同贮藏时间的叶片光谱反射率呈现较大差异，表明菠菜叶片光谱反射
7、率与贮藏时间存在一定的相关性。2.2 贮藏期间叶片细胞原生质 ATP 含量的变化菠菜叶片细胞原生质 ATP 含量在贮藏期间的变化动态如图 2 所示。由图可见，在温控贮藏之前，细胞原生质体 ATP 含量处于较低水平。经贮藏 24 h 后，ATP 水平有所增加，之后随着贮藏时间的延长(48 96 h)ATP 水平迅速降低。贮藏初期 ATP 含量的增加，可能与呼吸作用增强及其伴随而来的氧化磷酸化作用有关。因为收获后植株丧失了来自土壤的养分供应，细胞激活了以上生理机制，以维持 ATP 的合成，增加细胞活力。在此之后，由于缺乏持续的养分供应，ATP 含量总体呈下降趋势。ATP 含量与储存时间的变化动态可
8、以表示为一个二次多项式函数模型，如图 2 所示。该校准模型的决定系数(R 2)为 0845，表明细胞原生质体 ATP 含量与贮藏时间呈显著相关。利用此模型可以推算出，贮藏期间菠菜细胞原生质体的最高 ATP 水平为 87 10-15mole，该水平出现在贮藏后约 30 h。2.3 贮藏期间叶片光谱数据与细胞原生质体 ATP 含量的相关性分析不同贮藏期间菠菜叶片光谱反射率与其细胞原生质 ATP 含量的 Person 相关分析结果如图 3 所示。由图 3 可见，240418 nm，9441 012 和 1 1222 400 nrn 三个近红外波长范围的叶片光谱反射率与其细胞原生质 ATP 含量呈正相
9、关；420942 nm 和 1 0141 120 nrn 二个波长范围的叶片光谱反射率与其细胞原生质 ATP 含量呈负相关。其中，298nm 紫外光呈现最大的正相关性(r=0.896)，730 nm 近红外光呈现最大的负相关性(r=-0949)。此外，1 3821 892nnl 和 2 0362 400 nrn 两个近红外光波段范围均达到了较高的正相关水平(r085) ，530636 m 红光波段范围呈显著的负相关 (r-0.90)。2.4 预测模型的建立与评价根据相关性分析结果，选取 298 nm 紫外光和 730 am 近红外光两个特征波长，建立基于叶片光谱数据的细胞原生质体 ATP 含量
10、的预测模型，并用验证集数据进行验证。由图 4 可见，基于 298nm 紫外光和 730 nm 近红外光两个特征波长菠菜叶片光谱反射率建立的细胞原生质体 ATP 含量的预测模型均具有较好的预测效果，其模型的决定系数分别达到了 0.802 9 和 0.901。利用验证集菠菜叶片光谱和细胞原生质体 ATP 含量数据对预测模型进行检验，获得细胞原生质体 ATP 含量的预测值，并与其实测值进行 Person 相关分析。结果显示细胞原生质体 ATP 含量的预测值与实测值相关模型的决定系数分别达到了 0.7765 和0.8691。该结果表明，基于 298 nm 紫外光和 730nm 近红外光两个特征波长菠菜
11、叶片光谱反射率建立的细胞原生质体 ATP 含量的预测模型具有较高的一致性。3 结论探索了光谱技术在蔬菜细胞 ATP 含量检测和蔬菜新鲜度评价中应用的可行性。采用紫外- 可见- 近红外分光光度计 UV-3600 获取了菠菜叶片样本的光谱数据，并采用常规物理化学方法和萤火虫荧光素酶生物发光技术制备和测定了细胞原生质体悬浮液及其细胞原生质体的 ATP 含量。利用 person 相关分析确定了关键特征波长，并建立了基于 298 nm 紫外光和 730nn 外光两个特征波长菠菜叶片光谱反射率的细胞原生质体 ATP 含量的预测模型。结果分析表明， 298 nm光和 730 nm 近红外光两个特征波长具有预测细胞原生质体 ATP 含量的潜力。研究提出的基于光谱无损检测的蔬菜细胞 ATP 含量可作为蔬菜新鲜度和品质评价的一种新型评价指标，该评价指标及其基于光谱技术的无损检测方法为今后蔬菜新鲜度新型检测设备的研制奠定了重要的理论和技术基础。网址 http:/www.yunuo-
