1、1实验 1 植物组织渗透势的测定（质壁分离法）原 理当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。当用一系列梯度浓度溶液观察细胞质壁分离现象时，细胞的等渗浓度将介于刚刚引起初始质壁分离的浓度和尚不能引起质壁分离的浓度之间的深液浓度。代入公式即可计算出春渗透势。仪器药品显微镜 载玻片及盖玻片镊子 刀片配成 0.50.1mol/L 梯度浓度的蔗糖溶液各 50ml。称 34.23g 蔗糖用蒸馏水配成 100ml，其浓度为 1m0le/L（母液） 。再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液 2
2、5ml+水 25ml0.45mol/L：吸母液 22.5ml+水 27.5ml0.40mol/L：吸母液 20.0ml+水 30.0ml0.35mol/L：吸母液 17.5ml+水 32.5ml0.30mol/L：吸母液 15.0ml+水 35.0ml0.25mol/L：吸母液 12.5ml+水 37.5ml0.20mol/L：吸母液 10.0ml+水 40.0ml0.15mol/L：吸母液 7.5ml+水 42.5ml0.10mol/L：吸母液 5.0ml+水 45.0ml操作步骤将带有色素的植物组织（叶片） ，一般选用有色素的洋葱鳞片的外表皮、紫鸭跖草、苔藓、红甘蓝或黑藻、丝状藻等水生植物
3、，也可用蚕豆、玉米、小麦等作物叶的表皮。撕取下表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，510 分钟后，从0.5mol/L 开始依次取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微2镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。实验中必须确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁的角隅上分离的浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。将结果记录下表中。测出引起质壁分离刚开始的蔗糖
4、溶液最低浓度和不能引起质壁分离的最高浓度平均值之后，可按下列公式计算在常压下该组织细胞质液的渗透势。 RTiCs为细胞渗透势。sR 为气体常数=0.08310 5/LP/molK 。T 为绝对温度，单位 K，即 273+ t，t 为实验湿度。I 为解离系数，蔗糖为 1。C 为等渗溶液的浓度，单位为 mol/L。则： =0.083105(273+t )1Cs实验人 时期 材料名称 实验时室温 蔗糖摩尔浓度（mol/L） 渗透势（P ） 质壁分离的相对程度（作图表示）0.500.450.400.350.300.250.200.150.103实验 2 植物组织水势的测定（小液流法）原理水势表示水分的
5、化学势，象电流之由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势） ，则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度的变化，然后根据公式计算渗透势。仪器药品试管 毛细滴管移液管 剪刀镊子 甲烯蓝操作步骤首先配制一系列不同浓度的蔗糖溶液（0.1、0
6、.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L）各 10 ml 注入 8 支试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序在试管架上排成一列，作为对照组。另取 8 支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组的各试管中分别取溶液 4ml 移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。用剪刀将菠菜叶剪成约 0.5cm2大小相等的小块 6080 片。向试验组的每一试管中各加相等数目（约 10 片）的叶片小块，塞好塞子，放置 30 分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，向每一试管中各加甲烯蓝粉末少许，并振荡，此时溶液变成蓝色。用毛细滴管从试验组的各试管中依次吸取着色
7、的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢从毛细滴管尖端横向放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液滴移动的方向。如果有色液滴向上移动，说明溶液从细胞液中吸出水分而被冲淡，比重比原来小了；如果有色液向下移动，则说明细胞从溶液中吸了水，溶液变浓，比重变大；如果液滴不动，4则说明试验溶液的密度等于对照溶液，即植物组织的水势等于溶液的渗透势。记录液滴不动的试管中蔗糖溶液的浓度。重复测定一次。按 计算水势。式中 为细胞水势，其余符号同实验 4。RTiCww注意：毛细滴管要各个浓度专用。5实验 3 蒸腾强度的测定（钴纸法）原理本实验方法系根据氯化钴纸在干燥时为蓝色，当吸收水分后，变为粉红色，根据
8、变色所需时间的长短，然后按钴纸标准吸水量计算出作物蒸腾强度。仪器药品扭力天平 烘箱干燥器 瓷盘镊子 剪刀玻璃板 载玻片薄橡皮 有塞指管滤纸 弹簧纸夹5%氯化钴溶液（9.2g CoCl 16H2O 用蒸馏水配成 100ml）滴几滴盐酸调成弱酸性。操作步骤1氯化钻纸的制备选取优质滤纸，剪成 0.8cm 宽，20cm 长的滤纸条，浸入 5%氯化钴溶液中，待浸透后取出，用吸水纸吸去多余的溶液，将其平铺在干洁的玻璃板上，然后置于 6080烘箱中烘干，选取颜色均一的钴纸条，小心而精确地切成 0.8cm 的小方块，再行烘干，取出贮于有塞指管中，再放入氯化钙干燥器中备用。2钴纸标准化使用前，先将钻纸标准化。测
9、出每一钴纸小方块由蓝色转变成粉红色需吸收多少水量。取12 钴纸小方块，置于扭力天平上称重，并记下开始称重的时间，及每隔一分钟记一次重量，当钻纸蓝色全部变为粉红色时，要立即准确地记下重量和时间，如此重复数次，计算出钻纸小方块由蓝色变为粉红色时平均吸收多少水分，以 mg 表示，作为钴纸吸水量。3测定取二片玻片，薄橡皮一小块，在其中央开 1cm2的小孔，用胶水将它固定在玻片当中，另准备一只弹簧夹。用镊子从干燥器（管）中取出钻纸小块，放在玻片上的橡皮小孔中，立即置于待测作物叶子的背面（或正面） ，将另一玻片在叶子的正面（或背面）的相应位置上，用夹子夹紧，同6时记下时间，注意观察钻纸的颜色变化，待钻纸全
10、部变为粉红色时，记下时间。以时间的长短作相对比较，可用钻纸小方块的标准吸水量成小纸块由蓝色变为粉红色所需的时间来计算术为该叶片表面蒸腾的强度，用 mg/cm2min 表示之。本实验可选择不同作物的功能叶片，或同一作物的不同部位的叶片测其蒸腾强度，或者可测定作物在不同环境条件下的蒸腾强度。例如光和暗对植物蒸腾作用的影响，事先把一组盆栽的蚕豆、小麦或其他植物放在黑暗中过夜或几个小时，另一组放在光下，二者都要适当灌水，分别测其蒸腾强度（注：黑暗中的植物在测定时可移到实验室柔和的光线下进行） 。 每一处理最少要测 10 次左右，然后求其平均值。7实验 4 小孔的扩散（示范）原 理气孔蒸腾是植物散失水分
11、的主要途径，气孔口很小，其总面积一般不超过叶面积的1%，可是叶子通过气孔蒸腾所损失的水分却达到与叶面积相等的自由表面的 5080%，如此惊人的蒸腾量，可以用小孔扩散原理加以说明。水分通过小孔扩散的量和小孔的周缘长度成正比，而和小孔面积不成比例。通过此试验所产生的现象，可以证明小孔边缘效应的存在。仪器获品小烧杯 台天平培养皿 刀片尺及解剖针 卡片纸1%琼脂 石蜡红墨水或蓝墨水 酒糟或丙酮操作步骤1物质通过小孔扩散的途径预备聚乙烯塑料薄膜（可用食品袋）一张，大小约 55cm，取解剖针于煤气灯上加热，在薄膜中央穿刺一小孔。配制 1%琼脂，倒在一小烧坏中，如用 10ml 小烧杯，则更易于观察。待琼脂还
12、未完全凝固时，将薄膜小心地贴在琼脂的表面，使小孔位于烧杯的中央。等琼脂凝固后，在薄膜上面倒上有色溶液少许。45 小时后，即可看到有色溶液通过小孔向琼脂凝胶中扩散，形成一个有色的半球形，它显示染料通过小孔扩散的途径。2将卡片纸剪成与培养皿大小一致的圆片，然后在一张卡片纸的中部剪成一正方形大孔，每边长 3cm，则面积为 9cm2。在另一卡片纸上剪成数个小孔，其总面积与大孔完全相等。为此，将其剪成 9 个每边长 1cm 的正方形小孔，并使其均匀地分布在圆形卡片纸上。再将此卡片纸浸于熔化的石蜡中，取出盖于培养皿上，并用石蜡将边缘封严。于两皿中各加入等量的酒精（或丙酮） ，将此皿分别置于台天平两边用酒精
13、调节使之平衡。隔 1530分钟后，由于小孔具有较高的边缘效应，酒精蒸发较快，因此台天平指针倾向大孔一边，由此可看出孔的总面积虽相等，但酒精通过小孔的散失比大孔要快得多。证明小孔的边缘8效应要大，因其周缘长度比大孔大。9实验 5 单盐毒害及离了间拮抗现象原理离子间的拮抗现象的本质是复杂的，它可能反映不同离子对原生质亲水胶粒的稳定度、原生质膜的透性，以及对各类酶活性调节等方面的相互制约作用，从而维持机体的正常生理状态。仪器药品烧杯 纱布石蜡 0.12mol/L KCl0.06mol/L CaCl2 0.12mol/L NaCl（所用药品均需用 AR）操作步骤实验前 34 天选择饱满的小麦种子 10
14、0 粒浸种，在室温下萌发，待根长 1cm 时即可用作材料。取 4 个小烧杯，依次分别倒人不列盐溶液：（1）0.12molL KCI（2）0.06 molL CaCl 2（3）0.12 molL NaCI（4）0.12 molL NaCl 100 ml0.06 molL CaCl2 1 ml 十 0.12molL KCl 2.2 ml 小烧杯用涂石蜡的纱布盖上。挑选大小相等及根系发育一致的小麦幼苗 10 株或 20 株，小心种植在纱布盖的孔眼里，使根系接触到溶液，在室温下培育 23 星期后，即可看出在单盐溶液中，小麦幼苗生长，特别是它们的根部出现畸形。10实验 6 植物根系对离子的选择吸收原理植
15、物根系对不同离子吸收量是不同的，即使是同一种盐类，对阳离子与阴离子的吸收量也不相同。本实验是利用植物对不同盐类的阴、阳离子吸收量不同，使溶液的 pH 发生改变以说明这一吸收特性。此实验也使我们了解什么是生理酸性盐与生理碱性盐。仪器药品pH 计 精密 pH 试纸移液管 100ml 三角烧瓶0.5mg/ml（NH 4） 2SO4 0.5mg/ml NaNO3操作步骤1在实验前约 23 周按实验 19 方法培养根系完好的小麦（或其他植物）植株。2实验开始时吸取 0.5mg/ml 浓度的（NH 4） 2SO4 和 NaNO3 各 100ml 分别置于两个100ml 三角烧瓶中，另一三角烧瓶中放蒸馏水
16、100ml。用 pH 计或精密 pH 试纸测定以上各溶液和蒸馏水的原始 pH 值。3取根系发育完善的、大小相似的小麦 3 份，每份数株，但数目相等，分别放于上述3 个三角烧瓶中，在室温下经 2 一 3 小时后*取出植株，并测定溶液的 pH 值。实验结果按下表记录。植物从盐溶液中吸收离子后溶液 pH 值的变化pH 值处 理放植株前 放植株后0.5mg/ml（NH 4） 2SO40.5MG/ML NaNO3蒸馏水注：为了避免根系的分泌作用影响实验结果，故用蒸馏水作对照，将上述 pH 值变化进行修正，即得真实的 pH 变化。11实验 7 钾离子对气孔开度的影响原理保卫细胞的渗透系统歌可由钾离子所调节
17、，无论是环式或非环式光合磷酸化，都可形成 ATP。ATP 不断供给保卫细胞原生质膜上的钾氯离子交换泵作功，支持保卫细胞逆着离子浓度差而从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫细胞的渗透势，从而使气孔张开。仪器药品显微镜 镊子 温箱载玻片、盖玻片 培养皿0.5%硝酸钾 0.5%硝酸钠操作步骤1配 0.5%KNO3及 0.5%NaNO3溶液。2在 3 个培养皿中分别放 0.5%KNO3、0.5%NaNO 3及蒸馏水各 15ml。3撕蚕豆叶表皮若干放入上述 3 个培养皿中。4培养皿放入 25温箱中，使溶液温度达到 25。5将培养皿置于人工光照条件下照光半小时。6分别在显微镜下观察气孔的开度。12实验 8
18、植物的元素缺乏症（溶液培养）原理植物的生长发育，除需要充足的阳光和水分外，还需要矿质元素，否则植物就不能很好地生长发育甚至死亡。应用溶液培养技术，可以观察矿质元素对植物生活的必需性；用溶液培养做植物的营养试验，可以避免土壤里的各种复杂因素。近年来也已应用溶液培养进行无污染蔬菜的栽培生产。仪器药品分析天平 培养缸（瓷质或塑料）鱼缸打气泵 量筒烧杯 移液管按下表分别配制贮备液，所用药品均需为分析纯：药品名称 用 量（g/L）Ca（NO 3）2 82.07KNO3 50.56MgSO47H2O 61.62KH2PO4 27.22NaNO3 42.45MgCl2 23.81Na2SO4 35.51Ca
19、Cl2 55.50KCl 37.28Fe-EDTA Na2-EDTA 7.45g,FeSO47H2O 5.57g微量元素 H3BO3 2.860g,MnSO4 1.015g,CuSO45H2O 0.079g,ZnSO4.7H2O0.220G,H2MOO4 0.090g操作步骤131材料准备番茄、蓖麻、小麦、玉米等都作为材料。粒小的种子，从种了带来的营养元素少，缺乏症容易出现，粒大的种子可以在幼苗未做缺元素培养之前，先将胚乳（或子叶）除去，这样也可以加速缺乏症的出现。种子用漂白粉溶液灭菌 30 分钟，用无菌水冲洗数次，然后放在洗净的石英砂中发芽，加蒸馏水，等幼苗长出第一真叶时待用。2配制缺元素培
20、养液按下表用量配制缺元素培养液：贮备液（ml）贮备液 完全 -N -P -K -Ca -Mg -S -Fe 缺微量元素10 10 10 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 1010 10 10 10 10 10 101 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 10 10 10 10 Ca(NO3)2KNO3MgSO4KH2PO4Fe-EDTA微量元素NaNO3MgCl2Na2SO3CaCl2KCl 10 2.5 配制时先取蒸馏水 900ml，然后加入贮备液，最后配成 1 000ml，以避免产生沉淀。培养液配好后
21、，用稀酸、碱调节至 pH563培养观察先取大小一致的植株，用泡沫塑料包裹茎部，插入培养缸盖的孔中，每孔一株。将培养缸移到温室中，经常注意管理并观察，用蒸馏水补充缸中失去的水分。每隔一定时间（一周左右，随植株大小而定）更换培养溶液，并测定换出溶液的 pH。植株长大后要通气，通气可用鱼缸打气泵。注意记录植株的生长情况，各种元素缺乏症的症状及出现的部位。4元素缺乏症检索1老叶受影响。（1）影响遍及全株，下部叶子干枯并死亡。a.植株淡绿色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱缺 Nb.植株深绿色，并出现红或紫色，下部叶子发黄，叶柄短而纤弱缺14P（2）影响限于局部，有缺绿斑，下部叶子不干枯，叶子边缘卷曲呈凹凸不
22、下。a.叶子缺绿斑有时变红，有坏死斑，叶柄纤弱缺 Mgb.叶子缺绿斑，在叶边缘和近叶消耗或叶脉间出现小坏死斑，叶柄纤弱缺 Kc叶子缺绿斑，叶子包括叶脉产生大的坏死斑，叶子变厚，叶柄变短缺 Zn2幼叶幼叶受影响。（1）顶芽死亡，叶子变形和坏死。a.幼叶变钩状，从叶尖和边缘开始死亡缺 Cab.叶基部淡绿，从基部开始死亡，叶子扭曲缺 B（2）顶芽仍活着，缺绿或萎蔫而无坏死斑。a.幼叶萎焉，不缺绿，茎尖弱缺 Cub.幼叶不发生萎蔫，缺绿。（a）有小坏死斑，叶脉仍绿色缺Mn（b）无坏死斑，叶脉仍绿色缺 Fe（c）无坏死斑，叶脉坏死缺 S5待植株症状表现明显后，将缺元素培养液换成完全培养液，留下一株继续培
23、养，观察植株症状是否减轻以至消失。其余植株测量根、茎的长度，重量，叶子数目、大小和重量，节数和节间长度，然后在烘箱中烘干，作为实验 15、16、17、18 的材料，测定植株中的氮，磷，铁，铜的含量。15实验 9 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酸是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收各利用氮肥有关。它作用于NO-3 使还原为 NO-3；NO-3+NADH+H+NO -2+NAD+H2O产生的 NO-2 可以从级织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中 NO-2 含量的增加，即表现该酶活性的大小。这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。NO-2 含量的测定用磺胺对氨基苯磺酸胺（su
24、lfanil-amide）比色法。在酸性溶液中磺胺与 NO-2 形成重氮盐，再与 - 萘胺偶联形成紫红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml 含 0.5g 的 NaNO2。仪器药品721 型分光光度计 真空泵（或注射器）保温箱 天平真空干燥器 钻孔器三角烧瓶 移液管烧杯0.1mol/L 磷酸缓冲液，pH7.5（见附表 2） 。0.2mol/L KNO3：溶解 20.22gKNO3 于 1 000ml 蒸馏水中。磺胺试剂：1g 磺胺加 25
25、ml 浓盐酸，用蒸馏水稀释至 100ml。-萘胺试剂：0.2g-萘胺溶于含 1ml 浓盐酸的蒸馏水中，稀释至 100ml。NaNO2 标准溶液：1g NaNO2 用蒸馏水溶角成 1 000ml。然后吸取 5ml，再加蒸馏水稀释成 1 000ml，此溶液每 ml 含有 NaNO2 10g，用时稀释之。操作步骤1将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水先，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约 1cm 的圆片，用蒸馏水洗涤 23 次，吸干水分，16然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约 0.30.4g（或每份取 50 个圆片） ，分别置于含有下列溶液的 50ml 三角烧
26、瓶中：（1）0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（pH7.5）5ml+ 蒸馏水 5ml；（2）0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（pH7.5 ）5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用 20ml 注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中） 。将三角烧瓶置于 30温箱中，使不见光，保温作用 30 分钟，然后分别吸取反应溶液 1ml，以测定 NO-2 含量。注意取样前叶子要进行一段时间的光合
27、作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入 30g 3-磷酸甘油醛或1，6-二磷酸果糖，能显著增加 NO-2 的产生。2NO -2 含量的测定保温 30 分钟的结束时，吸取反应溶液 1ml 于一试管中，加入磺胺试剂 2ml 及 -萘胺试剂 2ml，混合摇匀，静置 30 分钟，用比色计进行比色测定，比色波长为 520nm，记下吸光度或透光率，从标准曲线上查得 NO-2 含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2g 或 mol 表示之。3绘制标准曲线测定 NO-2 的 磺胺比色法很灵敏，可以检出低于 1g/ml 的 NaNO2 含量
28、，可于 05g/ml 浓度范围内绘制标准曲线。由于显色反应的速度与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的 NaNO2 溶液（例如 5、4、3、2、1、0.5g/ml）1ml 于试管中，加入磺胺试剂 2ml 及 -萘胺试剂 2ml，混合摇匀，静置 303 分钟（或于一定温度的水浴中保温30 分钟） ，立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为 520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO 2 浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度-浓度曲线。1
29、7实验 10 叶绿体色素的提取和分离（纸层析法）原理叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要由叶绿素 a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用丙酮提取。分离色素的方法有多种，纸层析是其中最简便的一种。当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的混合物得到分离。仪器药品大试管 台天平研钵 量筒烧怀 漏斗软木层 新华滤纸丙酮 四氯化碳无水硫酸钠 碳酸钙石英砂操作步骤1称取新鲜叶子 2 g，放入研钵中加丙酮 5ml，
30、少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮 5 ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。2取准备好的滤纸条（22 cm） ，将其一端剪去两侧，中间留一长约 1.5cm，宽约0.5cm 的窄条，如图 7。3用毛细管取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多。如色素过淡，用电吹风吹干后再点 1 一 2 次。4在大试管中加入四氯化碳 35ml 及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰图到试管壁） ，盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。5经过 0.5 一 1 小时后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为
31、叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素 a，最后的黄绿色为叶绿素 b。 18实验 11 植物体色素及其性质原理植物色素包括脂溶性的叶绿体色素和水溶性的细胞波色素，前者存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素；后者存在于液泡中，特别与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。了解它们的性质有助于对其生理功能的理解。仪器药品分光计 天平研钵 分液漏斗移液管 量筒吸球 试管碳酸钙 氢氧化钾丙酮 乙醚甲酸 盐酸醋酸铜操作步骤1叶绿体色素的提取取菠菜（或其他植物）叶子 2g，放在研钵中，加石英砂和碳酸钙少许，丙酮约 5 ml，研磨成匀浆，再加丙酮 15 ml，则得深绿色提取液，用漏斗过滤之，即为色素提取液。2叶绿素的荧
32、光现象取上述色素丙酮提取液少许于试管中，用反射光和透射光，观察提取液的颜色有无不同，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色3光对叶绿素的破坏作用取上述色素丙酮提取液少许，分装在 2 支试管中，1 支试管放在黑暗处（或用黑纸包裹） ，另 1 支试管放在强光下（太阳光）经 2 一 3 小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？4，铜在叶绿素分子中的替代作用取上述色素丙酮提取液少许于试管中，1 滴 1 滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，19此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体 1 小块，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色。此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。5黄
33、色素和绿色素的分离取上述色素丙酮提取液 10 ml，加到盛有 20 ml 乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入 20ml 蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静置片刻，溶液即分为两层。色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液 12 次。然后于色素乙醚溶液中加入 5ml30%KOH 甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置 10 分钟，再加蒸馏水约 10 ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。6观察色素溶液的吸收光谱（1）调节分光计，观察电灯光的光谱。（2）观察色素丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释 1 倍比较之。（3）观察黄色素乙醚溶液，用乙醚将溶液稀
34、释 1 倍比较之。（4）观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释 1 倍比较之。（5）观察被光破坏的色素丙酮溶液，试与（2）作比较。（6）观察被铜取代了镁的色素溶液。20实验 12 叶绿素 a 和 b 含量的测定（分光光度法）原理如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽有明显的差异，但吸收曲线彼此又有些重叠；在这种情况下要分别测定两个组分，可根据 Lambert-Beer 定律，通过代教方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对吸光度的影响，最后分别得到两种组分的含量。如图 9 叶绿素 a 和 b 的吸收光谱曲线，叶绿素 a 的最大吸收峰在 663nrn，叶绿素 b 在 645nrn，吸收曲线
35、彼此又在重叠。根据 Lambert-Beer 定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度 C 与吸光度 A 之间有如下的关系（参阅实验 86）：A1=Caka1+Cbkb1A2=Caka2+Cbkb2式中：Ca 为组分 a 的浓度，gL。Cb 为组分 b 的波度， gL。Al 为在波长 1（即组分 a 的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度 A 值。A2 为在波长 2（即组分 b 的最大吸收峰波长）时，混合液的吸光度 A 值。kal 为组分 a 的比吸收系数，即组分 a 当浓度为 1g/L 时，于波长 1 时的吸光度 A 值。Kb2 为组分 b 的比吸收系数，即组分 b 当浓度为 1
36、gL 时，于波长 2 时的吸光度 A值。ka2 为组分 a（浓度为 1 g/L）在波长 2 时的吸光度 A 值。Kb1 为组分 b（浓度为 1 g/L）在波长 1 时的吸光度 A 值。从文献中可以查得叶绿素 a 和 b 的 80%丙酮溶液，当浓度为 1g/L 时，比吸收系数 k 值如下：波长（nm） 叶绿素 a 叶绿素 b663 82.04 9.27645 16.75 45.60将表中数值代入上式（1） 、 （2） ，则得：21A663=82.04Ca+9.27CbA645=16.75Ca+45.60Cb经过整理之后，即得到下式：Ca=0.012 7A6632.69A 645 (3)Cb=22
37、.9A6454.68A 663 (4)CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 (5)（5）式中 CT 为总叶绿素浓度，单位为 mg/L。利用上面（3） 、 （4） 、 （5）式，即可计算出叶绿素 a 和 b 及总叶绿素的浓度。注：一般大学教学实验室所用的人光光度计多为 721 型，属低级类型，其单色光的半波宽值要比中级类型的 751 型大得多，而叶绿素 a 和 b 吸收峰的波长相差仅 18nm（663645nm） ，难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更差了。根据公式计算往往会得到叶绿素 ab 值小于 1，这就不很奇怪了。除向学生说明
38、其中原因外，还可以在实验前对仪器的波长进行校正，使标称波长与实际波长一致。校正可用纯的叶绿素 a 和 b 进行，分别在波长 650670nm 和 630650nm 之间，每隔 12nm 测定叶绿素 a 或 b 的吸光度 A，以确定叶绿素 a 和 b 的吸收峰的波长。如果测得的峰值与文献上的峰值 663nm 和 645nm 不同，可按照仪器说明书步骤进行校正，或者更方便的方法可以打开仪器盖子，松动波长刻度盘紧固螺丝，调节刻度盘使波长至正确值，而后旋紧螺丝复原仪器。为校正仪器波长所需的叶绿素 a 和 b 的用量是很少的，用纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约 1g，用乙醚提取叶绿体色素，再用毛细
39、管将色素溶液画在 3mm 厚滤纸上使成一直线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于密闭容器中进行上行层析，溶剂为含 0.5%丙醇的石油醚。层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素 a 和黄绿素的叶绿素 b，注意剪时尽量避开有可能遭污染的地区。最后分别浸于 80%丙酮中，洗下叶绿素 a 和 b。22实验 13 叶绿体的分离原理分离叶绿体应在等渗溶液中制备，以减少渗透压对叶绿体的伤害，仔细研磨，然后离心取得叶绿体的悬浮液。整个过程应在 05下进行，所有提取物、溶液和材料，也应保存在该温度下，分离后活性测定工作应尽快进行。仪器药品离心机 天平容量瓶 量筒移液管 研钵烧杯 纱布0.35mol/
40、L NaCl 35m mol/L NaCl 10m mol/L Tris-HCl 缓冲剂， Ph7.8（见附表 2）操作步骤1最好在晴天上午 10 时左右，选取健康的菠菜叶（也可用豌豆叶） ，洗净，擦干，去叶柄及主脉，称取 10g 鲜重在冰浴中研磨。2研磨时加入 20ml 0.35mll/L NaCl，2ml 10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，以及少量石英砂。3研磨成匀浆后，用 4 层纱布过滤于烧杯中。4滤液用 1 000r/min 离心 2 分钟，弃去沉淀，收集上清液。5上清液用 3 000r/min 离心 5 分钟，弃去上清液，沉淀即是叶绿体。6将沉淀分成 2 份，分别加入 0
41、.35mol/L NaCl 溶液和 35mmol/L NaCl 溶液各 10 ml，制成悬液，使叶绿体分别处于等渗和低渗溶液中，以获得完整叶绿体和破碎叶绿体。保存在冰箱中，用于实验 41 的测定。23实验 14 离体叶绿体对染料的还原作用（希尔反应）原理离体的完整叶绿体，在合适的氧化剂存在下，例如染料二氯靛酚（DCPIP） ，当照光时，可以使水光解释放氧气，同时使染料还原，结果染料从原来的蓝色变为粉红色至无色。此反应为希尔所发现，故常称为希尔反应。可用分光光度计测定反应前后染料吸光度 A 的变化，变化在 45 分钟内呈线性关系。仪器药品721 型人光光度计 试管架烧杯 容量瓶移液管 试管100
42、m mol/L 磷酸缓冲液，pH7.3（见附表 2）0.3m mol/L 2， 6 二氯靛酚钠；称取 8.7mg 二氯靛酚钠，加蒸馏水定容至 100ml（如药品纯度低，可适当提高浓度） 。操作步骤1加样取干净试管 6 支，分为两组，并分别编成 1、2、3 号，然后按下表加入试剂。管号 磷酸缓冲液（ml）叶绿体悬液（ml）煮沸（分钟） 二氯靛酚（ml）完整叶绿体1239.49.49.90.20.20.250.50.5叶绿体碎片1239.49.49.90.10.10.150.50.5注：（1）叶绿体悬液为实验 40 所制备。（2）2 号管加叶绿体悬液后于沸水浴上煮 5 分钟，然后用蒸馏水补足丧失的
43、水分。（3）3 号管为比色时调节零点用。（4）各试管都在最后加入二氯靛酚以开始反应，并立即摇匀进行比色测定，以代表作用时间为 0。各管在加染料之前保存在冰浴中。242比色当加入染料后立即摇匀倒入相应的比色杯中，迅速测定吸光度，波长为 620nm，此即代表 0 时的吸光度。然后将比色杯置于离 150W 灯光约 60cm 处照光，每隔 1 分钟快速读下吸光度的变化，连续进行 5、6 次读数，严格控制照光时间。3将结果以每分钟 A620 的变化量（ A 620/min）为纵坐标，以时间（分钟）为横坐标作图。25实验 15 改良半叶法测定大田光合强度原理改良半叶法系将植物称叶片的一部分遮光或取下置于暗
44、处，另一部分则留在光下进行光合作用，过一定时间后，在这两部分叶片的对应部位取同等面积，分别烘干称重。因为对称叶片的两对应部位的等面积的干重，开始时被视为相等，照光后叶片重量超过暗中的叶重，超过部分即为光合作用产物的产量，并通过一定的计算可得到光合作用强度。仪器药品分析天平 烘箱剪刀 称量皿刀片 金属模板纱布 锡纸三氯乙酸操作步骤1选择测定样品在田间选定有代表性植株叶片（如叶片在植株上的部位、叶龄、受光条件等）20 张，用小纸牌编号。2叶子基部处理为了不使选定叶片中光合作用产物往外运，而影响测定结果的准确性，可采用下列方法进行处理：（1）可将叶子输导系统的韧皮部破坏。如棉花等双子叶植物的叶片，可
45、用刀片将时柄的外皮环割约 0.5 cm 宽。（2）如小麦、水稻等单子叶植物，由于韧皮部和木质部难以分开处理，可用刚在开水中浸过的纱布或棉花做成的夹子。将叶子基部烫伤一小段即可（一般用 90以上的开水烫20 秒） 。26（3）由于棉花叶柄木质化程度低，叶柄易被折断。用开水烫，又难以掌握烫伤的程度，往往不是烫得不够便是烫得过重而叶片下垂，改变了叶片的角度。因此可改用化学方法来环割，选用适当浓度的三氯乙酸，点涂叶柄以阻止光合产物的输出。三氯乙酸是一种强烈的蛋白质沉淀剂，渗入叶柄后可将筛管生活细胞杀死，而起到阻止有机养料运输的作用。三氯乙酸的浓度，视叶柄的幼嫩程度而异。以能明显灼伤叶柄，而又不影响水分
46、供应，不改变叶片角度为宜。一般使用 5%三氯乙酸。3剪取样品叶基部处理完毕后，即可剪取样品，记录时间，开始光合作用测定。一般按编号次序分别剪下对秋叶片的一半（主脉不剪下） ，按编号顺序夹于湿润的纱布中，贮于暗处。过 4一 5 小时后，再依次剪下另外半叶，同样按编号夹于湿润纱布中，两次剪叶的速度应尽量保持一致，使各叶片经历相等的照光时数。4称重比较将各同号叶片之两半按对应部位叠在一起，在无粗叶脉处放上已知面积（如棉花可用1.52cm）的金属模板，用刀片沿边切下两个叶块，分别置于照光及暗中的两个称量皿中，8090下烘至恒重（约 5 小时） ，在分析天平上称重比较。5计算结果叶片干重差之总和（mg）
47、除以叶面积（换算成 dm2，1dm 2=100cm2）及照光时数，即得光合作用强度，以干物质，mg/（dm 2b）表示之。计算公式如下：光合作用强度= )()(2hdmg照 光 时 数切 取 叶 面 积 总 和干 重 增 加 总 数 由于叶内贮存的光合产物一般为蔗糖和淀粉等，可将干物质重量乘系数 1.5，得二氧化碳同化量，单位为 CO2，mg/(dm 2h)。27实验 16 淀粉的合成淀粉磷酸化酶原理植物的组织中有一种淀粉磷酸化酶，能利用 1-磷酸葡萄糖合成淀粉，生成的淀粉可用I2-KI 染色检出。1-磷酸葡萄糖 淀粉 淀 粉 磷 酸 化 酶仪器药品台天平 离心机水浴锅 研钵移液管 1%1-磷酸葡萄糖0.1mol/L 柠檬酸-0.2mol/L 磷酸缓冲液，pH6.5 ， （见附表 2） 。I2-KI 溶液：溶液 1.5gKI 于少量
