逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响.docx

1、 1 / 8题目 逆境胁迫对植物生理生化指标的影响 学号 104120122 姓名 白 雪 洁 学院 生命科学学院 专业、班级 生科 10C 指导教师 王莎莎 云南师范大学教务处编印2 / 8逆境胁迫对植物生理生化代谢的影响104120122 白雪洁 生科 10C摘要：干旱、盐碱和低温是强烈限制作物产量的三大非生物因素,其中干旱造成的损失最大, 其损失超过其他逆境造成损失的总和。 对植物产生伤害的环境称为逆境，又称胁迫。常见的逆境有寒冷、干旱、高温、盐渍等。逆境会伤害植物，严重时会导致植物死亡。逆境对植物的伤害主要表现在细胞脱水、膜系统受破坏，酶活性受影响，从而导致细胞代谢紊乱。有些植物在长期

2、的适应过程中形成了各种各样抵抗或适应逆境的本领，在生理上，以形成胁迫蛋白、增加渗透调节物质（如脯氨酸含量） 、提高保护酶活性等方式提高细胞对各种逆境的抵抗能力。以小麦幼苗为材料，设置对照组，探究了干旱胁迫下脯氨酸（pro） 、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2 的含量变化以及抗氧化酶(POD、PPO)活性的变化。结果表明：在干旱胁迫下，脯氨酸（pro） 、谷胱甘肽(GSG)、丙二醛(MDA)、H2O2 的含量相对于对照组均有较明显的上升趋势，POD 和 PPO 活性也表现出较大水平的提高。关键词：干旱胁迫,抗逆性，脯氨酸，丙二醛，样品，细胞膜透性，过氧化物酶活性，叶绿素，可溶性糖。

3、谷胱甘肽；抗氧化酶；H2O2引言：干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一, 【1 】 干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程，涉及到许多生物大分子和小分子植物细胞膜起调节控制细胞内外物质交换的作用，它的选择透性是其最重要的功能之一。【2】 研究表明，游离的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫过程中扮演着越来越重要的角色，许多新的生理功能也逐渐被发现，近几年来有关脯氨酸的研究倍受科学工作者的关注 【9-13】 。干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物除进行气孔调节外，渗透词节也不夹为一种有效方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功 能。脯氨酸作

4、为水溶性最大的氮基酸(1623g (100g)。H 2O，25 oC)具有较强水合能力，是理想的渗透介质。作物遇旱时它的大量积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干早环境的一种保护性适应。已经证明了在逆境条件下脯氨酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化酶系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化活性的活性氧如 O2-、H 2O2、OH-等直接或间接地清除，防止了活性氧放大级联作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的

5、，对干旱也具有抵抗作用。GSH 作为生物体内主要的还原态硫之一，在生物体抵抗各种胁迫(冷害、干旱、重金属、真菌等)的过程中起着重要的作用，其含量水平的高低与植物对各种环境胁迫的忍耐程度密切相关。近些年来，它在高等植物代谢过程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧伤害过程中的作用及其与植物抗逆性关系的研究进展很快。前人研究进展植物在正常生长情况下, 活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当植物在逆境条件3 / 8下( 如干旱胁迫) 生长时, 这种平衡被打破, 体内负责清除活性氧的抗氧化系统能力下降, 从而造成活性氧的大量积累, 并引发或加剧膜脂过氧化作用, 导致生物膜系统受损。过氧化物酶( POD)

6、 、多酚氧化酶（PPO） 、过氧化物GSH(谷胱甘肽)等能够有效地清除这些自由基, 是酶促防御系统的重要组成成分。人们根据这一理论对干旱胁迫下的许多作物如小麦 【3-4】 、大豆 【5】 、辣椒 【6】 、胡杨 【7】 等逆境生理过程进行了研究。本实验切入点与其它作物相比, 小麦在干旱胁迫下具有独特的生存策略, 是一种公认抗逆性较强的作物, 利用干旱胁迫处理小麦幼苗, 测定其丙二醛( MDA) 含量、GSH 含量、脯氨酸含量、H 2O2含量及 PPO、 POD 活性变化, 探讨干旱胁迫对小麦幼苗膜脂过氧化及酶保护系统的影响, 为进一步明确大麦抗旱的生理机理提供一定理论依据。植物细胞膜对维持细胞

7、的微环境和正常的代谢起着重要作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温、干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以至于植物细胞侵提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。1 材料与方法1.1 种子发芽率的测定的材料培养和处理品种为晴 3 或鲁玉 13 的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司） ，用0.1%HgCL2 消毒 10min 后，用蒸馏水漂洗干净，再用蒸馏水于 26下吸胀 12h后即可用于实验。1.2 主要试剂：0.1% HgCl 2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA） ，

8、冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用 0.6% TCA 配制） ， PBS (pH=6.8，内含 1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4配制 ，PBS, （pH=5.8,内含 0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） ， POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚，5 mmol/L H 2O2,用PBS 溶解） ，PPO 反应混合液（ 20 mmol/L 邻苯二酚，用 PBS 溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用 0.1M pH=6.8PBS 现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加

9、样器，研钵等。1.3 余下实验材料培养和处理小麦种子吸胀 12h，在湿润滤纸上培养 7 天，正常组即对照组继续正常培养，干旱组即实验组再干旱处理五天后用于实验。2 方法2.1 种子发芽率的测定所采用的种子发芽率的测定方法是曙红染色法和 TTC 染色法。凡是有生命活力的种子胚部，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种子胚则无此反应。当 TTC 渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH 2 或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的 TTC 变为红色的 TTF【8 】 。用曙红染色的，凡是全部着色或胚已着色的种子表示失去了生活力,播后不能发芽，生活力强的种子是不会着色的,因为

10、活细胞具有半透性膜,可防止染料分子通过而不着色，死亡细胞,其壁膜失去半透性,染料分子易进入, 使原生质着色。各取 50 粒吸胀的小麦种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒） ，进行下列实验：其中 50 个半粒进行 TTC 染色（30水浴 20 min）; 另 50 个半4 / 8粒进行曙红染色（室温染色 10 min） 。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2.2 脯氨酸含量的测定用茚三酮法测定脯氨酸含量，在酸性条件下，茚三酮与脯氨酸反应生成红色化合物，在 520nm 下有最大吸收值。 【13 】 分别取 0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘加入 3 mL 3%磺基水杨酸（ SSA）和少

11、许石英砂充分研磨 用 2 mL 3% SSA 洗研钵5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL。上清液各 2 mL 分别加入2 mL 冰乙酸和 2 mL 茚三酮试剂 煮沸 15 min冷却后5000 rpm 离心 10 min 分别测定 A520。2.3 MDA 含量用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量 【18】 。分别取 0.1 g 实验组和对照组加入 3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂充分研磨用 2 mL PBS 洗研钵5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL。测定：分别取上清液各 2 mL 加入 0.6%TBA（用 0.6% TCA

12、配制） 2 mL煮沸12 min冷却后5000 rpm 离心 10 min 分别测定 OD450 和 OD532.计算公式：OD 450=C185.4OD532= C17.4+155000C2求解方程得：C 1/（mmol/L）=11.71 OD450C2/（ mol/L）=6.45 OD532- 0.56OD450,式中，C1 为可溶性糖的浓度，C2 为 MDA的浓度。2.4 抗氧化酶活性的测定用愈创木酚法测定 POD 活性，用邻苯二酚法测定 PPO 活性。在有过氧化氢存在的条件下过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量其含量，进而计算 POD 的活性。多酚氧化酶能使邻

13、苯二酚氧化生成醌，用比色法测量其产物的形成，进而计算出 PPO 的活性。POD 测定：取 POD 反应混合液（ 10mmol/L 愈创木酚， 5 mmol/L H2O2,用 PBS 溶解）3.00 ml，加入酶液 100 ml（空白调零用 PBS 取代） ，立即记时，摇匀，读出反应 3 min 时的 A470。PPO 测定：取 PPO 反应混合液（ 20 mmol/L 邻苯二酚，用 PBS 溶解）2.8 ml，加入酶液 0.2 ml（空白调零用 PBS 取代） ，立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的 A410。计算公式：POD activities = (mmol.g-1FWmin-1)用

14、总显 VtLA470PPO activities = (U.g-1FW)用总tw01.2.5 H2O2 含量测定H2O2 提取：分别取 0.5 g 实验组和对照组加入 3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂充分研磨用 2 mL PBS 洗研钵 5000 rpm 离心 10 min 上清液定容至 5 mL。5 / 8测定：分别取上清液各 3 mL 加入 0.1%Ti(SO4)2 用 20%(v/v) H2SO4 配制 1 mL摇匀 5000 rpm 离心 10 min OD410计算公式：H2O2 content = (mmol.g-1FW)用总显 VWLA

15、4103、 结果与分析。3.1 种子发芽率的测定分别计算两种方法的发芽率：小麦：TTC 法中， 3550=70%；曙红染色法中，3850=76%。玉米：TTC 法中， 3650=72%；曙红染色法中，3250=64%。3.2 脯氨酸含量的测定实验组：A520=0.088, 对照组：A520=0.060，计算公式：Pro content= ( mol.g-1FW)用总显520VWLA其中，V 显=6ml，V 总=5ml，V 用=2ml， 520=3.24 mol-1.cm-1,L=1cm,W=0.1g.计算结果：实验组脯氨酸含量为 4.074mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为2.777mol

16、.g-1FW.表一 Pro 正常组和实验组的 A520和 Pro content干旱胁迫 正常A520=0.088Procontent=4.074(mol.g -1FW)A520=0.060Procontent =2.777(mol.g -1FW)由上表可知，干旱胁迫下，脯氨酸的量是正常值的 1.47 倍，由此可以得到，干旱胁迫会造成脯氨酸的积累。但是，植物合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫的一个过程，因此，脯氨酸的积累可能是生物受胁迫的一个信号。当植物处于干旱条件下时，为了保护植物对干旱逆境的反应，在干旱胁迫下，脯氨酸的质量分数会急剧上升。而脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，这表明它具有易于水合的

17、趋势或具有较强的水合能力。它的增加可能是植物对干旱胁迫的一种保护性反应。3.3、MDA 含量测得的结果如下表所示：样品 TCC 方法 署红染色法 50 粒小麦种子 35 粒具生命力 38 粒具生命力 50 粒玉米种子 36 粒具生命力 32 粒具生命力 6 / 8OD450 OD532实验组 1.500A 0.454A对照组 0.380A 0.201A计算公式：OD 450=C185.4OD532= C17.4+155000C2求解方程得：C 1/（mmol/L）=11.71 OD450C2/（ mol/L）=6.45 OD532-0.56OD450,式中，C1 为可溶性糖的浓度，C2 为 M

18、DA的浓度。最后计算得出浓度如下表：实验组 对照组C1/（ mmol/L） 17.565 4.446C2/（ mol/L）2.088 1.084由上表可知，干旱胁迫下，丙二醛的浓度是正常情况下得 2 倍，因此，在干旱胁迫也会造成 MDA 的积累，MDA 的最大特点是对细胞质膜和细胞中的许多物质均有很强的破坏作用，因此，植物组织可能是通过产生并积累 MDA 等对细胞有害物质，进而破坏植物组织，使植物在逆境坏境中生长不好。3.4、抗氧化酶的测定POD 活性： 实验组为 85.51 U.g-1FW，对照组为 40.73 U.g-1FW.PPO 活性： 实验组为 4.38510-4 mmol.g-1F

19、Wmin-1，对照组为 4.00210-4 mmol.g-1FWmin-1。表三 正常组和实验 PPO 和 POD 不同时间所测得值 PPO 和 POD正常 干旱胁迫PPO A410=0.115（1 min20S） PPO A410=0.126（1 min20S）POD A470= 1.16（1min20S） POD A470=2.457（1 min20 s） PPO activities =4320(U.g-1FW) PPO activities = 4737(U.g-1FW)PODactivities=807.4(mol.g-1FWmin-1) PODactivities=1710.2(m

20、ol.g-1FWmin-1)以上数据是通过以下方程计算而得7 / 8用总显 VtWA470POD activities = (mol.g-1FWmin-1)用总t01.40PP tivities = (U.g-1FW)由上表可知，在干旱胁迫下，也会造成 PPO 和 POD 的积累。抗氧化酶的主要作用是消除 ROS 对植物的伤害，使抗氧化酶与 ROS 处于一个动态平衡。在干旱胁迫下，抗氧化酶总体增加，说明，这一个动态平衡体系被打破，使植物不能消除 ROS 对自身的伤害，因而，逆境下植物生长不好。3.5、 H 2O2 的测定 表五 正常组和实验组 H2O2的 A410和 H2O2 content

21、正常 干旱胁迫A410=0.623 A410=1.781H2O2content=10.09(mol.g -1FW) H2O2 content=28.86(mol.g -1FW)以上 H2O2 content 是通过以下公式计算而得： 用总显 VWLA410H2O2content = (mol.g-1FW)由上表可知，干旱胁迫下，也会造成过氧化氢的积累。过氧化氢是体内重要的代谢产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，其含量的高低，一定程度上反映了 CAT 活性的高低。因此，在干旱胁迫下，有可能是 CAT 酶活性降低，造成过氧化氢在植物体内的积累，从而破坏了细胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生长。4

22、 小结与讨论从实验中我们可以看到在干旱胁迫处理下，引起的一系列生理生化指标的差异性变化，相比于未作处理的小麦,经过干旱胁迫处理的小麦色素浓度明显增大，电导率大，过氧化物酶的活性较低，MDA 含量减少。【参考文献】【1】郑国华，张贺英，低温胁迫对批把幼果细胞超微结构及膜透性和保护酶活性的影响，热带作物学报，2008 年 12 月第 29 卷第 6 期。【2】 王学奎 主编，植物生理生化实验原理和技术（第 2 版）,高等教育出版社，2006 年版。【3】陈珂 徐刚 ，干旱胁迫对植物光合作用和活性氧代谢的影响， 安徽农学通报(下半月刊) 2009 年 16 期。【4】郑元，杨途熙，魏安智，宋晓军，杨

23、向娜，低温胁迫对仁用杏几个抗寒生理指标的影响，西北农林科技大学学报（自然科学版），2008 年 1 日第 36 卷第 1 期。8 / 8【5】王晓琴;玉米幼苗对水分胁迫的生理反应及其与品种抗旱性的关系研究 D;四川农业大学;2002 年。【6】侯嫦英;水分胁迫对青檀等树种生长及生理特性的影响 D;南京林业大学;2003 年。【7】康利平;干旱胁迫对豇豆幼苗生理生化及其显微结构的影响D;内蒙古农业大学;2004 年。【8】史建伟;张育平;王国昌;环境胁迫对植物体内非结构性碳水化合物的影响J;安徽农业科学;2007 年 09 期。【9】丁灿;杨清辉;李富生;林位夫;低温胁迫对割手密和斑茅游离脯氨酸含量的影响()J;安徽农业科学;2006 年 05 期。