1、呼吸道病毒感染与细胞凋亡?298?中华实验和临床病毒学杂志 2006 年 9 月第 2o 卷第 3 期ChineseJExpCllnViml,September2006,Vol20,No.3呼杭敏吸道病毒感染与细胞凋亡呼吸道病毒感染和细胞凋亡的关系是错综复杂的,既可以表现为抗凋亡作用,也可以表现为促凋亡作用.研究呼吸道病毒感染与细胞凋亡关系及凋亡的可能机制,将有助于进一步认识呼吸道病毒感染发生,发展及转归机制,为感染的防治提供一些新的思路.细胞凋亡(apoptosis), 又称程序性细胞死亡 (programmedcelldeath,PCD),是指在一定生理和病理情况下机体为维持内环境稳定,通
2、过基因调控而使细胞主动有序的消亡过程,是多细胞生物的一种生理性细胞死亡,在维持组织,器官的正常生理功能和形态方面起着非常重要的作用,它可由细胞内部因素和外部刺激所诱导.近年来研究发现病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系,许多病毒性疾病的发生都与细胞凋亡规律失常有关,病毒感染宿主细胞后,通过各种机制参与细胞凋亡的诱导或抑制.目前认为一方面宿主细胞可利用细胞凋亡清除病毒感染的细胞,加速感染细胞的死亡,继而能限制病毒的复制和传播,受病毒感染细胞的凋亡可由病毒特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL) 介导,也可以在无外界信号刺激情况下自发产生,这可能是机体针对病毒侵入而采取的防御机制之一;另一方面病毒基因
3、的表达和相应蛋白的合成抑制或者延迟被感染细胞发生凋亡,可能是病毒的一种生存机制.而某种病毒诱导细胞凋亡还是抑制凋亡,取决于多面因素.已知可诱导受染细胞凋亡的病毒,如 HIV.1 感染会导致 CD4(+)T 淋巴细胞 ,CD8(+)CTL 细胞,抗原呈递细胞(APc),神经细胞及神经胶质细胞等多种细胞的凋亡等;HBV 感染能引起肝细胞凋亡【2 等.而能抑制受染细胞凋亡病毒,如 EB 病毒编码的晚期膜蛋白 LMP.I 通过介导 Bc1.2和 Bn.1 等抗凋亡基因的表达来达到抑制凋亡的发生 J.还有一些病毒既能诱导感染细胞的凋亡,又能抑制感染细胞的凋亡,如 CMV,HSV.1 等.儿童病毒性肺炎是
4、儿科常见病,可由多种病毒感染引起,其中以呼吸道合胞病毒(rspimtorysyncytialvirus,RSV)最为多见,儿童下呼吸道感染中,45%9o%的支气管炎,5% 40% 的肺炎是由该病毒所致,次之是流感病毒(influenzavirus,IFv),副流感病毒(parainfluenzavirus,PIV)及腺病毒(Adenovirus,ADV)等.下面简要介绍上述病毒所致呼吸道感染与细胞凋亡的相互关系及其机制的研究进展.作者单位:100050 北京,首都医科大学附属北京友谊医院儿科通讯作者:杭敏,E.mail;mw727sina.tom1 呼吸道合胞病毒.综述.1.1 诱导细胞凋亡作
5、用RSV 感染可以引起宿主细胞凋亡增加,原代呼吸道上皮细胞包括原代人支气管.气管上皮细胞(primarynormalhumanbronchial-trachealepithelialceHs,NHBE),小气道上皮细胞(smallairwayepithelialcells,SAEC),人肺腺癌细胞株 (A549)等在感染 RSV 后发生凋亡增加.Kotelkin 等5 报道 ,NHBE,SAEC 感染 RSVA2 毒株(moi=2)24h 后,流式细胞仪 annexinV 分析,凋亡发生率分别为 4o%,70%;A549 细胞在感染后 48h,才出现凋亡的增加,凋亡发生率为 70%,且该细胞感
6、染RSVA2 毒株后 ,对肿瘤环死因子 (tumornecrosisfactor,rNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导的凋亡作用更加敏感,在感染后 24h,加 TRAIL 共同孵育 3h,即可见 A549 细胞发生凋亡.Bitko 等报道 A549 细胞感染 RSVLong 毒株(moi=5)后4h18h,琼脂糖凝胶电泳,原位末端标记(rUNEL)和 DAPI荧光染色法可见细胞染色体 DNA 断裂.Wang 等_7 发现 RSV毛细支气管炎患儿鼻咽部抽吸物和外周血的中性粒细胞凋亡发生率明显高于非 RSV 感染对照组,流式细胞仪分析annexinV 在中性粒细胞表面平均荧光强度 ,分别为
7、(105.318.1):(11.81.5),(105.318.1):(35.84.1),认为 RSV感染通过诱导免疫细胞凋亡,从而干扰机体免疫.另有学者报道,RSV 感染尽管能促进宿主细胞中一些促凋亡基因的表达上调,但最终并没有观察到形态学特征典型(泡状突起,特征的 DNA 梯状条带,核固缩,染色质凝聚等 )的凋亡细胞.Takeuchi 等报道 A549 细胞感染 RSVLong 毒株(moi=1)后 4h,即引起 A549 细胞中促凋亡基因干扰素调节因子(interferonregulatoryfactor-1,IRF-1)的表达上调;感染后 7h,又引起 A549 细胞中自细胞介素 1B
8、转换酶(Interleukin.10convertingenzyme,ICE)的表达上调;TUNEL 法没有检测到凋亡细胞.作者对此的解释是宿主细胞中促凋亡基因 IRF-1,ICE 表达上调的程度可能尚不足以激活蛋白酶的级联反应.RSV 诱导凋亡可能是由多种原因引起.Fas 基因是具代表性的凋亡相关基因,Fas(CD95)分子是细胞膜表面受体蛋白,属于 TNF 及神经生长因子受体(nervegrowthfactorreceptor,NGFR)超家族成员,它主要表达于成熟的淋巴细胞,心脏,肝脏等.FasL 是 Fas 的配体,为 TNF 同源的型穿膜蛋白,主要表达于活化的 T 淋巴细胞,二者是凋
9、亡过程中的重要调节因子,它们在 RSV 诱导凋亡过程中起很大作用.中华实验和临床病毒学杂志 2006 年 9 月第 20 卷第 3 期ChineseJExpClinVirol,September2OO6,Vol20,No.3?299?FasL 与靶细胞表面的 Fas 受体结合,向细胞内传导死亡信号 ,使靶细胞在数小时内发生凋亡,对免疫系统功能的调节起着至关重要的作用.Donnell 等发现 RSVA2 毒株感染 (moi=1)的 A549 细胞,核因子 IL-6(NF-II.6)很快升高,2h 后达最高,约为正常的 8 倍,其作为转录因子,可激活感染细胞的Fas 启动子,促进 Fas 基因的表
10、达上调,致使细胞表面的 Fas表达升高,诱导凋亡的发生;进一步采用抗 Fas 的中和抗体处理 A549 细胞,凋亡明显增加.TRAIL 蛋白是型跨膜蛋白,与 FasL 同属 TNF 家族成员;可与其相应的死亡受体 DR4,DR5 结合,启动凋亡的发生.Kotelkin 等报道 RSV 感染使A549 细胞内 TRAIL,DR4,DR5 表达均增加;加 TRAIL 共同孵育后,宿主细胞对凋亡的敏感性明显增加.一般认为病毒感染介导的靶细胞表面上调的 Fas,可与表达于 CTL 上或其他细胞上的 FasL 结合,导致受体的“死亡域“(deathdomain) 聚集,并结合一种含有死亡效应域的适配子蛋
11、白 FADD(Fasassoeiateddeathdomain,FADD),继而通过死亡效应功能区(deatheffectordomain,DED)与临近的 Caspase.8 结合,这种结合使 Caspase.8 的两个 DED 分开解除分子内的自我抑制,同时暴露 ICE 同源区,通过自我催化生成有活性的 Caspase-8,然后剪切 Caspase-1,经活化的 Caspase.1 将信号放大,激活蛋白酶链.Caspase.3,Caspase.6,Caspase.7 等通过裂解各种底物而致细胞凋亡.1.2 抗凋亡作用一些学者认为,RSV 感染可以抑制或者延迟被感染细胞发生凋亡,此种抑制作用
12、可能仅表现在 RSV 感染宿主细胞的早期阶段,病毒通过某些机制抑制或者延迟宿主细胞发生凋亡,此有利于病毒的生存和繁殖.RSV 感染宿主细胞后,可以引起某些抗凋亡基因的表达上调,从而使 RSV 发挥抑制凋亡作用.IEX.1L 是抗细胞凋亡基因 Bc1.2 同源体,具有抑制细胞凋亡的作用.Domachowske 等“ 报道 RSV 可依赖抗凋亡基因 IEX.1L 的表达上调从而抑制由 TNF.a 诱导的细胞凋亡.Hep-2 细胞感染 RSVB 毒株(moi=0.5)后,表现为 Hep.2 细胞IEX-1L 的表达上调,Northernblot 方法示细胞内 IEX.1L 水平上升至 7 倍.在原代
13、培养的上皮细胞中,DAPI 荧光染色法示在 TNF-a 处理的 RSV 感染组,其细胞凋亡发生率明显高于RSV 感染对照组,凋亡发生率分别为 23.4%和 5.0%.Kotelkin 等还发现 RSV 可依赖抗凋亡基因 Mc1.1 的表达上调,起延迟被感染细胞发生凋亡的作用.在 RSV 感染宿主细胞的早期阶段,可以诱导 Bcb2 家族中某些抗凋亡基因 Bc1.xl,Bc1.w,Mc1.1 和促凋亡基因 Bax,Bak,Bad 等的表达上调 ,但以 Mc1.1 基因的表达上调尤为明显,约为正常的 10 倍.Mc1.1也系抗细胞凋亡基因 Bc1.2 同源体,具有抑制细胞凋亡的作用.Monick 等
14、研究发现 RSV 感染后改变了促凋亡和抗凋亡的 Bc1.2 蛋白的平衡,即 Bc1.xl 增加,Bim.el 减少,促存活蛋白大量增多,受染细胞的寿命得以延长.Thomas 等“用 LY294002磷脂酰肌醇.3 激酶(Pl3.ki-nase,PI.3K)抑制剂预处理 A549 细胞 1h,再感染 RSVA2 毒株 6h 后,检测该组细胞凋亡的发生率明显高于 LY294002 处理的对照组,RSV 感染对照组和正常对照组,凋亡发生率分别为 19.86%,2.93%,0.08%和 0.37%.可认为是 LY294oo2的预处理使得受染细胞提前发生凋亡.因 LY294002 是 PI.3K的特异性
15、抑制剂,故考虑 RSV 感染抑制宿主细胞凋亡,是通过激活 P13K/AKT 信号传导路径所致,并且促使核转录因子(NF-B)诱导活化及炎症细胞因子合成,进而导致细胞死亡和严重的炎症反应.Krilov 等还发现 RSV 感染后从脐血和成人外周血分离的单个核细胞有很强的抗凋亡作用.RSVLong 毒株(moi=1)感染脐血和成人外周血分离的单个核细胞 24h,48h 后,亚二倍体峰检测及 Tunel 法检测均显示 RSV 感染组的细胞凋亡发生率明显低于对照组,以 RSV 感染脐血的单个核细胞组尤为明显.此现象似乎可以解释 26 个月的小婴儿感染 RSV 后引起的毛细支气管炎和肺炎比成人严重.2 流
16、感病毒IFv 结合于黏膜,气道上皮细胞并侵入上皮,引起中性粒细胞,巨噬细胞聚集,启动细胞因子合成,释放而致病.机体以相应的免疫机制与之抗衡,病程数天,仅有少数抵抗力弱的患者因病毒向下呼吸道扩散,引起间质性肺炎,部分患者出现了较为严重的一过性白细胞减少.现在认为,多数病毒株通过上皮细胞凋亡依赖的巨噬细胞作用有效清除病毒,过多凋亡则引起组织病理改变.少数病毒株则通过上调中性粒细胞表面 Fas 及 FasL 表达,增加中性粒细胞凋亡 ,造成小鼠对细菌继发感染抵抗力的下降,引起继发性细菌性肺炎.诱导 T 细胞凋亡异常增加引起免疫低下.Tumpey等用流感病毒香港/483/97 株 103pfu(41d
17、S0)接种小鼠鼻腔 ,2d 后外周血细胞总数开始明显下降,4d 后淋巴细胞分类计数下降 80%.支气管,肺及脾等器官的病理切片中组织细胞呈凋亡改变,淋巴结,肺的 CD4,CD8 淋巴细胞数及细胞因子 IL-ll3,IFN.y,巨噬细胞炎性蛋白 (MIP-1)等合成均减少.用流式细胞仪监测培养的受染 T 细胞凋亡前有 Fas 及 FasL表达同时上调,给 FasL 单克隆抗体则抑制其凋亡,据此认为流感病毒诱导凋亡与 Fas/FasL 有关.Schultz-Cherry 等研究发现甲型流感病毒 NS1(非结构蛋白基因)表达,可诱发MDCK 和 Hela 细胞的凋亡 .Morris 等认为甲型流感病
18、毒诱发细胞凋亡是一种多因素过程.无单一病毒蛋白能诱发凋亡,需要基因的联合,毒株产生凋亡具有毒株特异性.3 副流感病毒Sieg 等.加观察在体外副流感病毒 3 型(PIV3)诱导外周血单个核细胞产生 IL-10,而 IL-10 促进具有抑制病毒功能的T 细胞增殖和防止 PIV3 诱导的 T 细胞凋亡.Marques 等“ 发现 PIV 感染后的受染细胞通过下调 p53 基因(一种肿瘤抑制基因),促进细胞凋亡,限制了病毒复制.?300?4 腺病毒中华实验和临床病毒学杂志 2006 年 9 月第 20 卷第 3 期ChineseJExpClinViral,September2006,Vol20,No
19、.3现在发现腺病毒感染后的多器官损害及持续性肺部病变均与细胞凋亡密切相关.Yamada 等研究证实在接种了腺病毒 3 型的小牛肺炎模型中 3d 内均有大量细胞凋亡,年龄小的 5d 后凋亡减少,提示宿主防御机制导致的受染细胞的凋亡与年龄相关.总之,病毒和细胞凋亡的关系是错综复杂的,在 RSV 感染有些宿主细胞的早期,表现为抗凋亡作用为主,此有利于病毒在感染细胞内复制;而在 RSV 感染有些宿主细胞的晚期,表现为促凋亡作用为主,既可能是机体对病毒感染的防御反应,亦可能是病毒感染导致宿主组织细胞严重损伤的重要机制.宿主和病毒相互作用在机体不同免疫状况,病毒感染的不同时期和不同感染状态下会形成多种多样
20、的表现类型,从而构成病毒感染或病毒性疾病的发生,发展过程和结局的不同.因此,研究呼吸道病毒感染与细胞凋亡关系及凋亡的可能机制,将有助于进一步认识呼吸道病毒感染发生,发展及转归机制,为这些病毒感染的防治提供了一些新的思路.参考文献lZhaoXQ,HuangXL,GuptaP,eta1.Inductionofanti-humanim-munodeficiencyvirustypeI(HIV-1)CDSandCD4T-ceHreactivitybydendriticcellsloadedwithHIV-lX4-infectedapoptoticcells.JViro1.20o2.76:3OO7.30
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