1、引物设计说明(2009-05-13 09:35:28) 转载标签： 杂谈引物设计步骤：1查阅自己所需要基因的研究状况。用将各个相近或相关物种的氨基酸序列进行比对. www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/index.hteml 书写格式例如：portunus（物种名，只是一个标志）MVSRAHSRFSCQRTTLLAVVLLAVLWSSSLQQAAARVINDDCPNLMGNRDLYKKVEWICDDCANIYRSTGMASLCRKDCFFNEDFLWCVRATERSEDMMQLKQWVRILGAGRICamMMSRANSRFSCQRTWLLSVVVLAALWSFGVHRA
2、AARVINDECPNLIGNRDLYKKVEWICEDCSNIFRKTGMASLCRRNCFFNEDFVWCVHATERSEELRDLEEWVGILGAGRDCasMMSLAHSKFSCQRTRLLAVVLLAALWSSSLQQAAARVINDDCPNLIGNRDLYKKVEWICDDCANIYRSTGMASLCRKDCFFNEDFLWCVRATERSEDLAQLKQWVTILGAGRICapMMSRTESRYSSQRTWLLSMVVLAALWSISVQRATARVINDDCPNLIGNRDLYKKVEWICEDCSNIFRNTGMATLCRKNCFFNEDFLWCVYATERTEEMSQL
3、RQWVGILGAGREChfMMSRANSRFSCQRTWLLAVVVLAAIWSSSLHQAAARVFNDDCPNLMGNRDLYKKVEWICDDCANIFRIPGMASICRKDCFFNEDFLWCVRATERTEEMMQLKQWVRILGAGRMMee AMYRMPMRFWLTAVVMVVVGALLLDTASASYIENTCRGVMGNRDIYKKVVRVCEDCTNIFRLPGLDGMCRDRCFNNEWFLVCLKAANRDDELDKFKVWISILNPGLliv1MYRLAMKTWLAIVIVVVGTSLFFDTTSASFIDGTCRGVMGNRDIYKKVVRVCEDCTNI
4、FRLPGLDGMCRDRCFYNEWFLICLKAANREDEIEKFKVWISILNAGQ(碱基比对同理)2根据比对结果，找出保守氨基酸即功能氨基酸的位置。然后进一步确定碱基在总 cDNA 中的位置。3 确定正向引物和反向引物的位置。应该尽可能包括所有的保守序列。4 利用 Primer 5.o 确定合适的引物位置。5 送引物，引物书写均为 5-3 ，运用 www.expasy.org/ 可以将碱基序列翻译为氨基酸序列进行比对确认。1 送引物，引物书写均为 5-3 ，运用 www.expasy.org/ 可以将碱基序列翻译为氨基酸序列进行比对确认。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特
5、异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的 PCR 扩增子，在 EB 染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一 PCR 循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果 PCR 的退火温度设置在近于引物 Tm 值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18 到 24 个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化 PCR 反应，使用确保溶解温度不低于 54的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。
6、每增加一个核苷酸，引物特异性提高 4 倍；这样，大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（1824 聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的 3末端形成的二聚体，应控制其 G 大于- 5.0kcal/mol 或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或 5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以 3端或近 3端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，
7、与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免 3末端有发卡结构的引物。引物 GC 含量和 Tm 值PCR 引物应该保持合理的 GC 含量。含有 50的 G+C 的 20 个碱基的寡核苷酸链的 Tm 值大概在 5662范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了 Tm 值导致特异性的丧失。这种情况下引物 Tm 值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm 值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种 GC 含量和 Tm 值的协调非常关键。一般来说，
8、一对引物的 Tm 值相差尽量不超过 23 摄氏度，同时引物和产物的 Tm 值也不要相差太大，20 摄氏度范围内较好。引物的额外序列与退火温度若有额外的序列信息要加到引物中，例如 T7RNA 聚合酶结合位点、限制酶切位点或者 GC 发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物 5端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行 4 到 5 个扩增循环；然后在假定引物 5端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。引物的 3末端核苷酸组成引物 3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物 3末端最后
9、 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物 3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在 3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的 PCR 产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR 状态，从而影响扩增成功。引物 3末端的稳定性由引物 3末端的碱基组成决定，一般考虑末端 5 个碱基的 G。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则 3末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。需要注意的是，引物 3末端应
10、尽量避免 T。实验证明，以 T 结尾的引物即使与 T, G 或 C 错配仍可有效延伸。PCR 产物的长度及在耙序列内的位置所有的计算机程序都提供对 PCR 产物长度范围的选择。一般说来，PCR 产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异 DNA 片段的临床检验方法，120300bp 的小 DNA 扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。其他 PCR 方法有不同的最佳产物长度
11、。例如，通过定量的 RNA-PCR 检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在 250750bp 范围内。补充说明若在 cDNA 序列内找寻 PCR 引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在 mRNA 的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像 3末端非编码区域与许多其他 mRNA 有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使 RNA 特异的PCR 产物与从污染 DNA 中产生的产物在大小上相区别。若 PCR 的目的是克隆一个基因或 cDNA 的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。在选择用来扩增来自不同物种 DNA 的引物时，应避开 mRNA 的 5和 3末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。
