1、 西北大学学报(自然科学网络版) 2004 年 10 月，第 2 卷，第 10 期Science Journal of Northwest University Online Oct. 2004, Vol.2. No.10收稿日期：2004-05-31基金项目：陕西省教育厅专项科研计划资助项目（03JK111）;陕西省博士后科研经费基金资助项目（BX03003）审稿人：田呈瑞，男，陕西师范大学食品工程系教授，博士生导师。蜂花粉提取物抗氧化作用的研究厉 阗，曹 炜，宋纪蓉（西北大学 化工学院，陕西 西安，710069）摘要：为进一步开发利用蜂花粉资源，研究 5 种蜂花粉活性成分的抗氧化性。采用超
2、声法，以甲醇 为溶剂提取 5 种蜂花粉活性成分；测定提取的 5 种蜂花粉活性成分对超氧阴离子自由基、羟基自由基、 DPPH 自由基的清除率和脂质过氧化的抑制率。 结果表明：5 种蜂花粉均具有 较强的抗氧化作用，其中 荞麦花粉甲醇提取物对超氧阴离子的清除作用和脂质过氧化的抑制能力最强；油菜花粉甲醇提取物对羟基自由基和二苯代苦味酰（DPPH）自由基的清除能力最强。 认为蜂花粉是一种有前途的天然抗氧化剂。关键词：蜂花粉；抗氧化作用；甲醇提取物中图分类号：Q5 文献标识码 ：A 文章编号： 1000-274X(2004)0089-06生物体系中存在着大量的脂质氧化和自由基反应。现代医学研究证明，衰老、
3、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧化和自由基有着直接的关系 1 。自由基会使体内的脂质和蛋白质发生链式反应，造成相关细胞结构与功能的破坏，其氧化产物和中间产物也会导致生物膜、酶、组织、基因等损伤，使人体发生病变。在抗氧化酶与内源抗氧化剂的合成量降低的情况下，如果不及时从体外补充外源性抗氧化剂以提高机体抗氧化能力，人体就会加速衰老、易患疾病。天然抗氧化剂有抑制体内脂质过氧化和氧自由基的作用，同时可促进体内抗氧化酶与内源性抗氧化剂的合成。因此，对清除自由基和抑制脂质过氧化作用的天然抗氧化剂研究，己得到普遍关注 2。花粉是植物的雄性生殖细胞，它存在于雄蕊的花药之中。蜂花粉是蜜蜂采集花粉后用自己的唾液和花
4、蜜粘合形成的颗粒，比单一花粉更有营养价值 3。蜂花粉中含有黄酮类、维生素、激素、核酸、酶类和微量元素，具有特有的抗衰老作用，是良好的抗氧化食品。蜂花粉的种类不同，所含成分有很大区别，因此研究不同种类蜂花粉的抗氧化作用具有重要的价值。本文研究蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子、羟基自由基、DPPH 自由基的清除与脂质过氧化的抑制作用，通过对比不同蜂花粉对氧自由基的清除率和脂质过氧化的抑制作用，为开发利用蜂花粉资源提供依据。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 样品与试剂 油菜蜂花粉、荞麦蜂花粉、茶叶蜂花粉、芝麻蜂花粉、益母草蜂花粉由陕西老蜂农蜂业有限责任公司提供；二苯代苦味酰自由基( DPPH)为
5、Sigma 公司产品，分析纯；甲醇、硫代巴比妥酸（TBA）等均为国产分析纯试剂。1.1.2 仪 器 UV-751 型紫外可见分光光度计，上海分析仪器总厂；KQ-250DB 型数控超声波清洗器，2昆山市超声仪器有限公司。1.2 方 法1.2.1 蜂花粉活性成分的超声萃取 称取干燥后的 5 种蜂花粉各 2 g，分别用 30 mL 甲醇在常温下超声提取 30 min，过滤后，滤渣再提取一次，合并滤液，弃去滤渣。将所得滤液用旋转蒸发器浓缩，加甲醇定容至 10 mL 备用。1.2.2 蜂花粉甲醇提取物的抗氧化作用的测定1）蜂花粉对超氧阴离子自由基的清除作用。采用邻苯三酚自氧化速率测定法，25下，在 4.
6、5 mL K2HPO4-KH2PO4 缓冲液(pH 8.30)中加入 7.5 L用 10 mmol/L HCl 配成的 50 mmo1/L 邻苯三酚溶液，迅速混匀，倒入光径cm 的石英比色杯内，在 325 nm 波长光线下，每隔 30 s 测吸光值（A）一次。提取物对碱性邻苯三酚体系产生的超氧阴离子自由基的清除作用按文献4的方法进行。抑制率=(A 自氧化 A 样品 )/ A 自氧化 100%式中： A 自氧化 为自氧化对照值， A 样品 为 样品值。2）蜂花粉对羟基自由基的清除作用 5，6 。在 10 mL 硬质试管中，依次加入 KH2PO4-K2HPO4(PH7.4)缓冲液 0.4 mL，一
7、定量的样品液（1.04 mmol/L EDTA-1mmol/L FeSO4-1 mmol/L Vc 0.1 mL） ，12 mmol/L H2O2 0.1 mL，60 mmol/L 脱氧核糖(DR)0.05 mL，定容为 1.0 mL。然后，将试管置于 37的恒温水浴锅中保持 1 h，取出，迅速添加 1 mL 10% TCA(三氯乙酸) 及 1% TBA 1 mL,在 100沸水中加热 15min，取出，冷却，于 532 nm 处测吸光值。按下式计算清除率抑制率=A 模型 -(ADR-A 样品 )/A 样品 100%式中： A 模型 为 模型管吸光度（不加样品），A DR 为加入清除剂和 DR
8、 后的吸光度，A 样品 为样品本身的吸光度（不加 DR）。3）蜂花粉对DPPH自由基的清除作用 7。蜂花粉提取液2 mL 及210 -4 mol/L DPPH溶液2 mL加入同一试管中，摇匀。30 min后用溶剂作参比测定其吸光度 i ,同时测定210 -4 mol/L DPPH 溶液与2 mL甲醇溶剂混合后的吸光度A C，以及蜂花粉提取液 2 mL与2 mL溶剂混合后的吸光度A j ，根据公式计算抑制率抑制率=1-(A i-Aj)/AC100%4）蜂花粉对脂质过氧化的抑制作用 8。取 0.2 mL 卵磷脂溶液，加入样品，加入 50 L FeSO4(347.5 mg FeSO4，35 mg V
9、c，定容至 25 mL)溶液，加 PBS 缓冲液(p7.4) 定容至 3 mL，37 育温 40 min，每5 min 摇匀一次。然后，加入 TCA 和 1%硫代巴比妥酸 1 mL，摇匀，100水浴 15 min，5 000 r/min 离心10 min，于 532 nm 处测定吸光度，用蒸馏水做空白。抑制率=(A 模型 A 样品 )/(A 模型 A 空白 )100%式中 ： A 模型 为模型管的吸光度，A 样品 为样品的吸光度，A 空白 为 空白管的吸光度。2 结果与分析2.1 对超氧阴离子自由基的清除作用3超氧阴离子自由基是第一个生成的氧自由基，又是所有氧自由基的前身，可以转化为其他氧自由
10、基。因此，对超氧阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成，具有非常重要的意义。图 1 为 5 种蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子自由基的清除作用。由图 1 可知：5 种蜂花粉对超氧阴离子自由基均有一定的清除能力，且清除率随提取物加入量的增加而增大，清除能力依次为荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉；加入量 20 L时，荞麦蜂花粉的清除率达 27.2%，其他 4 种蜂花粉的抑制率 7.4%16.9%，表明此用量下的 5 种蜂花粉清除率较低；随着加入量进一步增大，5 种蜂花粉和芦丁对照品清除率逐渐增大，当加入 120 L时荞麦、芝麻、油菜、茶叶、芦丁、益母草蜂花粉的清除
11、率分别为 92.1%、86.5% 、83.2%， 、76.3%、70.2% 、64.3%，表明此用量下的荞麦、芝麻、油菜蜂花粉、茶叶蜂花粉提取物的清除能力强，而益母草蜂花粉提取物的清除能力相对弱。图 1 5 种蜂花粉甲醇提取物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.1 Scavenging Effect of Five Kinds of Bee Pollen Extracts on Superoxide Radical2.2 对羟基离子自由基的清除作用羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基，也是毒性最大的自由基，几乎能与活细胞中任何分子发生反应，且反应速度极快。图2为5种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由
12、基的清除作用。图 2 5 种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由基的清除作用清除率/%加入量 /L荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉0204060801000 100 200荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉清除率/%607080901001100 10 20 30加入量/ L4Fig .2 Scavenging effect on OHof Five Kinds of Bee pollen extracts从图2可见：5种蜂花粉甲醇提取物对羟基离子自由基均有较强的清除能力，且清除率随提取物加入量的增加而增大，清除能力依次为茶叶蜂花粉油菜蜂花粉
13、芦丁对照品荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉益母草蜂花粉；在反应体系中加入茶叶和油菜花粉提取液5 L的清除率分别为86.9%、83.6% ，清除能力较弱的益母草蜂花粉提取物的清除率为65.3%；当提取液加入量为25 L时，茶叶、油菜、荞麦、芦丁、芝麻、益母草蜂花粉提取物的清除率分别为99.4%、95.3%、93.8%、92.1%、89.3% 、86.2%。2.3 对 DPPH 自由基的清除作用DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在 515 nm 处有强吸收，在有自由基清除剂存在时，DPPH 的孤电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关
14、系。因此，可通过在此波长处吸光度的测定来评价自由基的清除情况。在 0.025 mgmL DPPH 自由基的反应体系中，各种花粉溶剂提取物对 DPPH 自由基的清除能力如图3 所示。由图 3 可见：5 种蜂花粉甲醇提取物对 DPPH 自由基清除能力依次为油菜蜂花粉荞麦蜂花粉芦丁对照品茶叶蜂花粉芝麻蜂花粉益母草蜂花粉；在反应体系中加入 10 L油菜、荞麦蜂花粉提取液，清除率分别为 83.2%、 80.3%，芝麻蜂花粉提取物对 DPPH 自由基的清除率为 65.2%；随着花粉提取物加入量的增大，清除率也逐渐增大，当加入 80 L时，荞麦、茶叶、油菜蜂花粉甲醇提取物的清除能力均在 95%以上，芝麻蜂花
15、粉清除能力也达 93.3%，益母草蜂花粉的清除能力较弱，为 88.2%，表明 5种蜂花粉对 DPPH 自由基都有很强的清除能力。图 3 5 种蜂花粉甲醇提取物对 DPPH 自由基的清除作用Fig. 3 Scavenging effects of five kinds of bee pollen extracts on DDPH2.4 对脂质过氧化的抑制作用脂质过氧化作为动脉粥样硬化的病因之一，可以启动某些引发动脉粥样硬化的反应，而在动脉粥样硬化发生发展的过程又会加重脂质过氧化反应。清除率/%加入量/ L607080901001100 20 40 60 80 100荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉
16、茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉55 种蜂花粉提取物对脂质过氧化体系的抑制作用结果见图 4。由图 4 可知：5 种蜂花粉提取物对其均有抑制作用，其抑制作用随提取物加入量增大而增强，油菜蜂花粉提取物对脂质过氧化体系的抑制作用最强，反应体系中加入 5L甲醇提取物时，抑制率为 80%，加入 60L时，抑制率达 96.2%；荞麦蜂花粉对脂质过氧化体系的抑制作用最弱，加入 5L时抑制率仅 31.2%，加入 60L时抑制率为 65.4%；对脂质自由基的清除能力依次为油菜蜂花粉益母草蜂花粉芦丁对照品芝麻蜂花粉荞麦蜂花粉。图 4 甲醇提取 5 种蜂花粉对脂质过氧化体系的抑制作用Fig .4 Antioxida
17、tive activity of five kinds of bee pollen extracts to Lipid peroxidation3 结 论1）本文仅对 5 种蜂花粉甲醇提取的体外抗氧化活性进行了初步研究，蜂花粉已被应用于制造保健食品，其在体内的氧化作用有待进一步研究。2)蜂花粉中含有大量的黄酮类化合物和酚性化合物，这些化合物对蜂花粉抗氧化能力的贡献率值得进一步研究。3) 蜂花粉是较强抗氧化性的保健食品，有很大的开发前景。参考文献：1 方允中,郑荣梁. 自由基生物学的理论与应用M.北京：科学出版社，2002.2 张燕平. 天然蜂胶对自由基的清除作用J . 食品与发酵工业， 200
18、2，28(l)：48-52.3 王开发. 花粉营养成分与花粉资源利用M . 上海：复旦大学出版社， 1993.4 庞战军，周 玫，陈 瑗. 自由基医学研究方法M . 北京：人民卫生出版社，2000.5 HALLIWELL B，GUTTERRIDE J M C，ARUMOA O I. The deoxyribose method：A simple “Test Tube”assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radical J. Analytical Biochemistry， 1987,165：21
19、5-219.6 李小定，荣建华，吴谋成. 灰树花多糖 PGF-1 题外对羟基的抑制作用J . 食品科学，2003，24(7)：126-130. 7 张尊听，杨伯伦，刘谦光，等. 野葛根异黄酮成分的超声萃取及抗氧化作用 J. 食品科学，2002，23(5)：清除率/%加入量 /L204060801000 20 40 60 80荞麦蜂花粉芝麻蜂花粉油菜蜂花粉茶叶蜂花粉芦丁对照品益母草蜂花粉631-33.8 吕晓玲，朱惠丽，姜平平，等. 紫苏提取物抗氧化活性体外实验研究 J. 中国食品添加剂,2003，(5) ：22-25.（编 辑 张银玲）A study on the antioxidant ac
20、tion of bee pollen methanol extractsLI Tian，CAO Wei， SONG Ji-rong（Department of Chemicol Engineering, Northwest University, Xian 710069,China）Abstract: Aiming at the further exploration of bee pollen resource, a study the antioxidant action of five kinds of bee pollen is made. The activity component
21、 was extracted with methanol through the method of ultrasonic wave. The antioxidant action of the activity component towards superoxidized anionic radical, hydroxyl radical, lipid radical and DDPH was tested. (The antioxidant action of the activity component was determined through the method of supe
22、roxidized anionic radical, hydroxyl radical, lipid radical and DDPH). Results showed that the extracts of the bee pollen could inhibit lipid peroxidation and scavenge active oxygen free radicals. The bee pollen of rape extracts showed the highest scavenging effects on the hydroxyl radical and DPPH a
23、nd the bee pollen of buckwheat extracts showed strongest inhibitory effect on the antioxidation of superoxidized anionic and lipid peroxidantion.Key words: bee pollen；antioxidant action；methanol extracts作 者 简 介厉 阗，男，生于 1970 年 10 月， 陕西西安人。硕士生。1995 年毕业于郑州工学院化工系有机工艺专业，同年到西安化工学校任教，主要从事精细化工产品化学及应用、有机化学、高等有机化学、分离工程等教学工作，2000 年被评为讲师 ，。2002 年到西北大学化工学院攻读硕士学位，开始蜂花粉保健食品的研究，主要从事花粉的黄酮类物质的提取方法、抗氧化性、成分分析等研究工作。
