1、黄芩苷酶的制备及其理化性质研究任慧霞 张 敏 山东大学药学院 生化与生物技术药物研究所（济南 250012）摘 要：目的 研究黄芩苷酶的制备及其理化性质。方法 采用提取、透析、sephadex G150 凝胶柱层析及冷冻干燥的方法获得黄芩苷酶；利用Linewear-Burk作图法求得该酶对黄芩苷的Km值，研究了pH值、温度、离子强度、底物浓度等对黄芩苷酶活力的影响。结果 该酶对黄芩苷的Km值为 57.4mmol/L，最适pH值为5.8，温度为45，不同离子的影响、分子量 ，底物浓度及产物对该酶活性基本无影响，反应初速度随酶浓度的增加而增加并呈现良好的线性关系。结论 获得活性较高理化性质较稳定的
2、一种黄芩苷酶。关键词：黄芩苷；糖苷酶；理化性质关于Preparation and Characterization about flavonoids Glycosidase REN Hui-xia ZHANG Min, Institue of Biochemical and Biotechnological Drug, School of Pharmaceutical Science, Shandong University, Jinan 250012Abstract：Purpose To measure the Km of this flavonoids Glycosidase from S
3、cutellaria baicalensis Georgi with baicalin，study the effect of pH , temperature, ionic strength and subst rate concent ration on enzyme activity, and the linear relation of enzyme concentration.Methods Using means of collection and dislysis,sephadex G 150 column chromatography to prepare crude enzy
4、me.Measuring Km by Linewear-Burk graphic method, calculate the enzyme activity by measuring the absorbance of baicalein at 450nm with ultraviolet spectrophotometry. Results The Km with baicalein is 57.4mmol/L,its optimum pH , temperature, ionic strength and subst rate concent ration is 5.8, 45, 1mol
5、/L，40mmol/L，respectively.Conclusion The physico-chemical property of this new flavonoids Glycosidase from Scutellaria baicalensis Georgi was studied.Key words: Glycosidase; Characterization；糖苷酶是指一类以内切或外切方式水解各种含糖化合物(包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙、糖蛋白等) 中的糖苷键,生成单糖、寡糖或糖复合物的酶，它是维持生物体基本功能的重要酶类之一,在自然界广有分布,几乎各种类型的动、植物和微生物
6、中,都有糖苷酶存在 1，2 。常根据其降解的底物对其命名，,如水解 -D-葡萄糖苷键的酶称为 -D-葡萄糖苷酶，水解甘露糖苷键的酶称为甘露糖苷酶。本实验室研究的主要是能将黄芩中黄芩苷降解为黄芩素的一类糖苷酶，故称之为黄芩黄苷酶。黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根。在临床中属常用中药，用于治疗上呼吸道感染、泌尿系统感染、菌痢、肝炎、高血压等 3。黄芩苷(baicalin) 是黄芩中主要的有效成分之一,属葡萄糖醛酸苷类,水解后产生黄芩素和葡萄糖醛酸,具有清热解毒、抗炎、利胆、降压、利尿、抗变态反应等多方面的作用 4。本文主要对其理化性质进行
7、了初步的研究，测定了其动力学常数 Km 值，考查了 pH 值、温度、离子强度、底物浓度对酶活力的影响，以及酶浓度的线性关系。1 材料与方法1.1 材料酶提取植物原料，实验室购得；黄芩苷标准品，实验室自制；黄芩素标准品，实验室自制；透析袋， ；sephadex G 150，SIGMA 公司；其他试剂均为国产分析纯。AKTA explorer 快速蛋白质纯化系统, Amersham Biosciences 公司；UV-2102 PC 型紫外可见分光光度计， Unico 上海仪器有限公司；冷冻离心机，Heraeus 公司； FD-1-55 冷冻干燥机，北京博医康试验仪器有限公司。 方法1.2.1 粗
8、酶的分离纯化1.2.1.1 原料的预处理：称取原料植物干燥粉末 25g，加入十倍体积的蒸馏水溶解 置于 45烘箱内过夜后，抽滤，弃残渣保留上清液，备用。1.2.1.2 透析除去小分子：取上述上清液加入透析袋内，用蒸馏水磁力搅拌透析，直至外液无色为止。1.2.1.3 sephadex G 150 柱色谱：上述透析产物在室温条件下使用 AKTA 分离层析系统上 sephadex G 150 柱色谱，洗脱液是经过滤和脱气的蒸馏水，流速为1.0mL/min。分部收集，检测酶活力并收集有酶活力的洗脱液。1.2.2 酶活力单位 IU 定义 测定条件下(pH 值为 5.8，45)每小时催化水解黄芩苷生成 1
9、mol 产物黄芩素所需的酶量为 1 个酶活力单位（IU） 。1.2.3 粗酶活性测定：在空白和试验管中各加入 一定量的标准黄芩苷溶液，在 45下水浴，再在试验管中加入相同体积的粗酶液，混匀，同时空白管中加入等体积的蒸馏水，45下精确反应一定时间后，取出冷却至室温，后 8000r/min离心 20min ,倒出上清夜，保留沉淀，试验管沉淀用等量的甲醇溶解，空白管倒出上清夜后加入甲醇溶液做为对照，采用分光光度法在 450 nm 处测定其吸光度。1.2.4 黄芩素标准曲线制作：配置 一定浓度的黄芩素标准溶液（溶剂为甲醇） ，然后用甲醇（分析纯）依次稀释至不同浓度，再以甲醇为空白，在 450nm 处测
10、定各个浓度黄芩素溶液的吸光度，黄芩素溶液浓度为横坐标 ，吸光度为纵坐标，做出标准曲线。1.2.5 动力学常数（Km）的测定：粗酶液与不同浓度的黄芩苷反应，利用反应中止法测定酶反应的初速度（V） ，再根据 Linewear-Burk5作图法求得该粗酶对黄芩苷的 Km 值。1.2.6 理化性质1.2.6.1 pH 值对酶活力的影响 在不同的 pH 值（4.0，5.0，5.8，7.0，8.77，10.08）的缓冲液中，其他条件不变，测定酶活力。1.2.6.2 温度对酶活力的影响 在不同温度（4，25，35、40、45，50 和60、70、80）下水浴恒温 24h 后，按常规方法测酶活。1.2.6.3
11、 离子强度对酶活力影响 在酶反应液中分别加入不同浓度(0，0.1 ，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0molL)的 Nacl 溶液，其他条件不变，测定酶的活力。1.2.6.4 底物浓度对酶活的影响 将不同浓度（0，1.60，3.20，4.80，8.01，12.81，16.02，24.02，32.03，40.04，48.05mmol/L）的底物与相同量的粗酶液反应，测定酶活，观察与底物浓度的关系。 1.2.6.5 不同酶浓度的线性关系考察 取分离得到的粗酶样品液梯度稀释，测定酶活性。2 结果2.1 sephadex G 150 柱色谱结果经 sephadex G 150 柱色
12、谱可将透析产物分成 3 个组分，并测得第一个组分有活性( 图 1)。2.2 黄芩素标准曲线 用不同浓度的黄芩素标准溶液绘制浓度和吸光度的黄芩素的标准曲线（图 2） 。y = 0.176xR2 = 0.998400.10.20.30.40.50 0.5 1 1.5 2 2.5 3浓 度 （ mol/L）吸光度（Abs）2.3 Km 值 用 Linewear-Burk 作图法求出该酶对黄芩苷的 Km 值为57.4mmol/L（图 3） 。-0.08-0.06-0.04-0.0200.020.040.060.080.1-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.21/S1/V图
13、3 黄芩黄酮糖苷酶的 Linewear-Burk 图2.4 理化性质2.4.1 pH 值对酶活力的影响 该酶在pH5.0-7.0的范围内活性较高，最适pH值为5.8（图4） 。-0.500.000.501.001.502.002.503.003.500 2 4 6 8 10 12pH值酶活力（IU）图 4 pH 值对酶活力的影响2.4.2 温度对酶活力的影响该酶对温度较敏感，当温度升高到45后，酶活力开始下降，80时已经失活，最适温度为45（图5） 。0.000.501.001.502.002.500 20 40 60 80 100T/酶活力（IU)图5 温度对酶活力的影响2.4.3 离子强度
14、对酶活力影响在酶反应液中分别加入不同浓度氯化钠(04mol/L)的氯化钠溶液，随着离子强度的升高，酶活力逐渐增大，但是当离子强度升高到1mol/L后，酶活力开始下降，因此最适氯化钠浓度为1mol/L（图6） 。0.000.200.400.600.801.001.200 1 2 3 4 5氯 化 钠 浓 度 （ mol/L）酶活力（IU）图6 离子强度对酶活力的影响2.4.4 底物浓度对酶活的影响 随着底物浓度的升高，酶活力逐渐增大，且与底物浓度成正比，当底物浓度达到40mmol/L时，酶活力达到最大，底物浓度继续增大，酶活力基本保持不变（图7） 。0.000.200.400.600.801.0
15、01.201.401.601.800 10 20 30 40 50 60底 物 浓 度 （ mmol/L）酶活力（IU）图7 底物浓度对酶活力的影响2.4.5 不同酶浓度的线性关系考察 酶浓度对反应速度呈良好的线性关系（图8） 。y = 0.5722xR2 = 0.997100.10.20.30.40.50.60.70.80.910 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6酶 浓 度吸光度（Ab）图 8 不同酶浓度的线性关系3 讨论由于此种黄芩糖苷酶是本实验室从植物中提取的一种糖苷酶，通过溶解过滤后得到的原料液，以透析的方法，大量透去小分子物质，后经 sephedex G15
16、0凝胶过滤后得到单一组分的粗酶，利用这一粗酶进行理化性质的研究。由于此种糖苷酶与黄芩苷作用，将其降解得到黄芩素，不容易水，而易溶于甲醇，可用分光光度法在 450 nm 处测定，方法简单、反应活性大，所以本实验采用黄芩苷作为底物的分光光度法测定该酶活性。考查了 pH 值、温度、离子强度、底物浓度对酶活力的影响，以及酶浓度的线性关系。pH 值和温度的影响图形都呈倒钟型分布，对酶活力的影响较大，最适 Nacl 离子强度和底物浓度分布为1mol/L 和 40mmol/L。理化性质的研究，为其今后深入的性质和应用研究奠定了基础，同时也提供了有力的依据和参考。参考文献1 Jacobson R ,Schle
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