1、壳聚糖纳米粒与细胞相互作用的机制研究郑爱萍 a, b 刘会雪 a 袁兰 c 孟萌 a 王坚成 a 张烜 a 张强 a,d*a 北京大学药学院 b 军事医学科学院毒物药物研究所 c 北京大学医学分析中心d 国家天然与仿生药物重点实验室中文摘要：目的：探讨壳聚糖纳米粒与细胞间相互作用的机制，并阐明其与壳聚糖分子作用机制的异同。方法：以 Caco-2 细胞为细胞模型，考察壳聚糖纳米粒和壳聚糖分子的经细胞摄取机制，并采用激光共聚焦技术观察骨架蛋白F-actin 及紧密连接蛋白 Zo-1 的结构变化，进一步运用 FTIR 技术、Raman 技术及荧光偏振技术考察对壳聚糖纳米粒和壳聚糖分子对细胞膜流动性的
2、影响以及利用 SPR 技术实时检测纳米粒与细胞的相互作用。 结果： 壳聚糖纳米粒经Caco-2 细胞的摄取与壳聚糖的分子量和脱乙酰度密切相关，即壳聚糖的分子量越大，脱乙酰度越高，则壳聚糖纳米粒经细胞的摄取量越大。壳聚糖分子经Caco-2 细胞的摄取仅与壳聚糖的脱乙酰度有关，而壳聚糖的分子量不能影响其摄取。激光共聚焦显示壳聚糖纳米粒能够与细胞发生相互作用，并且纳米粒通过穿细胞途径进入细胞。此外，壳聚糖纳米粒主要存在于 Caco-2 细胞单层的顶端，难以到达基底端，而壳聚糖分子仅吸附于绒毛层，不能向壳聚糖纳米粒那样插入膜内。对于紧密连接蛋白，壳聚糖及壳聚糖纳米粒能够造成 F-actin 环的缺失，
3、使得 F-actin 环显示不连续，并能使紧密连接上的 ZO-1 蛋白解散，并且壳聚糖纳米粒的作用强度大于壳聚糖分子。傅立叶红外光谱法（FTIR） ，激光拉曼光谱法（Raman）和荧光偏振法的结果表明壳聚糖纳米粒能增加膜脂的流动性，降低膜的微粘度，改变膜蛋白构象，这些作用都有利于药物的跨细胞转运。SPR 技术表明壳聚糖纳米粒或壳聚糖分子与 C6 细胞间具有很强的相互作用，折射率变化较大，在作用 30min 内，SPR 信号升高并且具有浓度依赖性。结论：壳聚糖纳米粒是口服给药系统的优良载体，壳聚糖纳米粒与壳聚糖分子的作用机制不同。关键词：壳聚糖 纳米粒 Caco-2 细胞 相互作用Study o
4、n the Mechanism of Interactions between Chitosan Nanoparticles and Live Cells Aiping Zheng, a b Huixue Liu, a Lan Yuan, c Meng Meng, a Jiancheng Wang, a Xuan Zhang, a and Qiang Zhanga, d,*a School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100083； b Institute of Pharmacology Toxicology，
5、the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850； c Medical and Healthy Analytical Center, Peking University, Beijing 100083； d State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs(Peking University), Beijing 100083.ABSTRACT Objective: Study on the mechanism of interaction between chitosan n
6、anoparticles(CS-NPs) and cells, also to elucidate the similar and difference between CS-NPs and chitosan (CS) molecules. Methods: Caco-2 monolayer was selected as model cell, cellular uptakes of CS-NPs and CS molecules were carried out in order to evaluate the effects of molecular weight and degree
7、of deacecylation. In laser confocal scanning microscope (LCSM) study, the effects of CS-NPs or chitosan molecules on the cell skeleton protein (F-actin) of Caco-2 cells were carried out. Some physicochemical methods were used to explore the mechanism of CS-NPs acting on Caco-2 cells, including Fouri
8、er transformed infrared spectroscopy (FTIR), Raman spectrum and fluorescence polarization. For further study, surface plasmon resonance (SPR) was also employed to monitor the interaction between molecules and cells online. Results: Uptake of CS-NPs and CS by Caco-2 cells was quantified by fluorometr
9、y. Resluts indicated nanoparticles uptakes was a saturable event for all samples, with the binding affinity and uptake capacity decreasing with decreasing polymer molecular weight and degree of deacecylation. While uptake of CS molecules did not exhibit saturation kinecits and was less dependent on
10、the molecular weight and degree of deacetylation. CS-NPs and CS molecules are able to open the tight junction. Furthermore, CS-NPs were able to interact with the cells and could enter the celles by a transcelluar pathway. On the other hands, CS molecules hadnt crossed the Caco-2 monolayer and remain
11、ed at the apical side of the monolayer. Hence, transforming CS into nanoparticles modified the mechanism of cellular uptake. For the further study, the effects of CS-NPs or CS molecules on the tight junction protein (Zo-1) of Caco-2 cells were carried out by LCSM, Results indicates that CS-NPs or CS
12、 molecules can depolymerize the stereo-chemical structure and CS-NPs exhibited a stronger influence. Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR), Raman spectrum and fluorescence polarization indicated CS-NPs could increase the fluidity of membrane lipids, decrease the micro-viscosity of membran
13、e and change the conformation of membrane proteins. SPR signals induced by CS-NPs and CS 资金项目：国家自然科学基金 (No. 30430760).作者简介：郑爱萍 女 博士 通讯作者：张强 男 教授 博士导师 E-mail：molecules in living C6 cells were monitored and analyzed by the SPR based cytosensor. The signal began to increase within 30min after the addit
14、ion of CS-NPs or CS molecules. These responses were strongly dependent on the concentrations of CS-NPs and CS. Conclusion: CS-NPs were an excellent vector for oral administration, and there was significantly different mechanism between CS-NPs and CS. Key words: chitosan; nanoparticle; Caco-2 cells;
15、interaction口服给药是患者最易接受的给药方式，具有简单、方便、快捷的特点，但由于肝脏的首过效应及胃肠道消化酶的降解破坏使得很多药物的口服生物利用度很低，尤其是蛋白多肽类药物只能通过注射途径给药，从而给患者带来极大痛苦和不便。近十几年来，随着新型载体材料的涌现，药物新剂型及新型给药系统的发展日新月异，其中口服纳米载体给药系统由于具有巨大的表面积能够显著地提高药物的生物利用度，并具有改善难溶药物的口服吸收以及靶向和定位释药的特点等而成为目前药剂学研究的热点 1-6。壳聚糖（Chitosan）是由天然高分子甲壳素衍生而得到的一种氨基多糖，是自然界唯一存在的荷正电荷的碱性多糖，具有生物黏附性
16、及吸收促进作用，因此是粘膜给药系统的优良载体 7。壳聚糖纳米粒已在口服、鼻腔、肺部、直肠等给药系统中获得广泛研究，尤其对于蛋白多肽类药物的口服给药系统 8-10。已有相关研究阐明壳聚糖分子的促吸收作用机制，但有关壳聚糖纳米粒的作用机制的研究较少，尤其是两者之间作用机制的异同比较还未见相关报道。因此本研究以壳聚糖纳米粒作为研究对象，运用荧光探针技术，综合分子生物学、细胞生物学以及生物物理学等交叉学科的知识，系统开展载体给药系统与细胞相互作用的机制研究，考察壳聚糖纳米粒的经细胞摄取机制、对细胞膜流动性的影响、对紧密连接蛋白的影响以及实时检测纳米粒与细胞的相互作用，并进一步阐明与壳聚糖分子的作用机制
17、的异同。一材料与仪器药品与试剂：壳聚糖（山东青岛思特有限公司） ；三聚磷酸钠（pentasodium tripolyphosphate，TPP，天津市天河化学试剂厂） ； DMEM培养基（GIBCO公司，USA） ；标准胎牛血清（FBS，Hyclone ，USA） ；非必须氨基酸（Nonessential amino acids）购自GIBCO公司（美国 )；特级胎牛血清 (FBS) 购自Hycolone 公司（美国)；青霉素、链霉素、胰蛋白酶(Trypsin, 1：250) 、EDTA购自 Sigma 公司（美国)；罗丹明- 鬼笔环肽（ Rhodamine-phalloidin，Molecu
18、lar Probes Corporation） ，台盘蓝（北京五七六零一有机化工厂） ，Triton X-100（Sigma 公司） ；ZO-1 单克隆抗体和 TRITC标记的羊抗兔IgG二抗购自（Santa Cruz Biotechnology, USA），罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine -Phalloidine）和Hoechest购自分子探针公司(Molecular Probes) ；SP-葡聚糖凝胶C-25（Pharmacia 公司） ；异硫氰酸荧光素（Sigma公司） ；碳酸氢钠（分析纯，北京化学试剂有限公司） ；Transwell 培养板(聚碳酯膜，1.13cm 2，孔径3.0
19、m，12 孔，COSTAR，Camgridge，MA，USA)； HEPES（Sigma 公司） ；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。细胞：人结肠腺癌 Caco-2 细胞株及大鼠 C6 神经胶质瘤细胞(C6 glioma cells)，均购自 ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)， 实验用的细胞代数分别在 25-50 代及 32-40 代。仪器： XDS-1B 倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司) ；TDL-5-A 低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)；上皮细胞电阻仪(EVOM, World Precision
20、 Instrument，Sarasota，FL，美国)；超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)；HZS-H 水浴震荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)；精密电子天平(北京赛多利斯有限公司)；自控式座式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗机械厂)。50ml塑料离心管（Corning 公司） ，25ml 和 50ml 细胞培养瓶（ Corning 公司） ，激光共聚焦荧光显微镜（Leica, TCS NT 型，德国） 。荧光分光光度计（RF-5301 日本岛津） ，冷冻干燥机（ALPH2-4, Christ 德国） ， 85-2 恒温磁力加热搅拌器（上海国华企业） ，WH-2 微型漩涡混合仪（上海沪
21、西分析仪器厂） ，二氧化碳培养箱（Galaxy B，RS biotech ） 。二实验方法1. FITC-CS 标记物的制备将 100mgFITC 溶解于 50ml 无水乙醇中，溶解完全后再加入 100ml 无水乙醇，另，实验前将 CS 溶解于 0.1M 醋酸液中，浓度为 1，隔夜充分溶胀，用1 mol/L NaOH 溶液调整其 pH 值至 6.0，然后将 FITC 溶液 150ml 滴加入100mlCS 溶液中，放置暗处，避光反应 3h。标记产物用 0.2MNaOH 溶液沉淀，并于 40,000g 离心 10min，用甲醇：水 (70：30，V/V) 洗涤沉淀，并用紫外分光光度计检测上清液中
22、游离 FITC(exc490nm， emi520nm)，反复洗涤，直至上清液中检测不出游离 FITC，然后将标记物 FITC-CS 重新溶解于20ml0.1MHAc 溶液中并转移到透析袋中，避光，放置于 5L 蒸馏水透析 3 天，每 6h 更换新鲜蒸馏水，最后将 FITC-CS 冷冻干燥。2. FITC-CS 纳米粒的制备采用离子胶凝法制备壳聚糖纳米粒 11。将 10mg FITC-CS 溶于 5ml 醋酸水溶液（0.3 v/v）,隔夜充分溶胀，2mg TP5 溶解在 0.2ml 氢氧化钠溶液(0.1M)中，并与 1.8mlTPP 溶液(2mg/ml)混合，在室温磁力搅拌下，将此液 (pH=1
23、1.8) 缓慢滴加到上述壳聚糖溶液中，滴加完毕后继续搅拌 10min，即得。3. Caco-2 细胞培养Caco-2 细胞（美国 ATCC 提供，细胞代数 2535 代 ）按 4105密度接种于培养瓶中，培养基为高糖型 DMEM (Dulbeccos Modified Eagles Medium；4.5 gL-1 D-葡萄糖，3.7 gL-1 NaHCO3), 另含有 10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，100 UmL-1 青霉素和 100 gmL-1 链霉素，置于 37恒温培养箱，通入 5 % CO2中培养（相对湿度 90） 。每隔两天换一次液，当细胞达到90%的汇合时，可收集细胞。对于摄取实
24、验，将细胞密度按 5104/ml 接种到 6 孔培养板中，接种后隔天换液，一周后每天换液，培养至 7 天用于药物的细胞摄取实验。对于转运实验，将细胞密度按 5104/ml 接种到 Transwell培养板的 Apical 侧，接种后隔天换液，一周后每天换液，培养至 21 天用于药物的细胞转运实验。跨膜电阻值 TEER 值均 700 cm2 可用于转运试验。4. 壳聚糖纳米粒及壳聚糖分子经 Caco-2 细胞的摄取参考 Behrents 的方法用 Caco-2 单细胞层研究细胞的摄取实验 12，并有所改动。将 Caco-2 细胞的密度按 5104/ml 接种到附有盖玻片的 6 孔细胞培养板中，接
25、种后隔天换液，一周后每天换液，培养至 15 天用于细胞摄取实验。将培养15 天的 Caco-2 细胞用 37Hanks 缓冲溶液洗涤 2 次，然后加入不同分子量和不同脱乙酰度的壳聚糖纳米粒溶液或壳聚糖溶液各 2ml，终浓度均为0.5mg/ml，置于 37的培养箱中培养 1h，取出后加入 4冰冷的 Hanks 缓冲溶液终止药物的摄取实验，并快速地洗涤细胞三次。用 0.5%Triton X-100 的氢氧化钠溶液溶解细胞，一部分用于测定 FITC-NPs 含量，一部分用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白含量。5. 激光扫描共聚焦荧光显微镜观察纳米粒的摄取 摄取实验结束后，移去溶液，细胞用Hanks等渗缓冲溶
26、液洗涤两次，加入1g.ml-1 的Hoechst 33258溶液，在37 C下标记30min, 用等渗液洗涤细胞后，再用3.7% 的甲醛溶液在室温固定10分钟，接着用0.1%的TritonX-100抽提3-5分钟，再用磷酸缓冲溶液（pH=7.4 ）洗涤细胞二次以上；将 5l的Rhodamine-phalloidin甲醇储备液用缓冲溶液稀释到200l，然后在室温染色20分钟，再用缓冲溶液（pH=7.4）洗涤细胞二次以上，在激光共聚焦显微镜下进行观察, 激发波长360nm，发射波长440nm。6. 壳聚糖纳米粒对细胞F-Actin 蛋白的影响Caco-2细胞以510 4/ml的密度接种到附有盖玻片
27、的6孔细胞培养板中，接种后隔天换液，一周后每天换液，培接种在6孔细胞培养板生长约三星期，用等渗溶液洗涤后，加入一定浓度的CS或CS-NPs溶液，37 C温育1小时，移去溶液后，细胞用HBSS (Hanks等渗缓冲液)洗涤两次，再加入1g/ml的Hoechst 33258溶液，在37C 下标记30min, 用等渗液洗涤细胞后，再用 3.7%的甲醛溶液在室温固定10分钟，接着用0.1%的TritonX-100 抽提3-5分钟，再用磷酸缓冲溶液(pH=7.4)洗涤细胞二次以上；将5l的 Rhodamine-phalloidin甲醇储备液用缓冲溶液稀释到200l，然后在室温染色20 分钟，再用缓冲溶液
28、(pH=7.4)洗涤细胞二次以上，90甘油封片后，用激光共聚焦显微镜观察，激发波长360nm ，发射波长440nm。7. 壳聚糖纳米粒对细胞ZO-1蛋白的影响Caco-2 细胞以 5104/ml 的密度接种在 6 孔细胞培养板生长约三星期，用等渗溶液洗涤后，加入一定浓度的 CS 或 CS-NPs 制剂在培养箱中 37共育培养4h。培养结束后，将液体析出并加入 HBSS 洗涤三次。然后加入 3.7多聚甲醛室温孵育 20min 固定细胞，吸取固定液，用 HBSS 洗涤三次以上，充分去除残留固定液。加入 0.1Triton X-100（PBS） ，室温放置 30min。PBS 漂洗，100ml/L
29、小牛血清白蛋白封闭 1h，然后加入 2g/ml 的 ZO-1 一抗， 4过夜，用 HBSS 充分洗去多余一抗，加入 FITC 标记山羊抗兔 IgG 二抗于 37孵育1h，然后用 HBSS 吸去多余二抗。90甘油封片后，用激光共聚焦显微镜观察，激发波长 490nm，发射波长 535nm。8. 细胞膜流动性的测定Caco-2细胞以510 4/ml的密度接种在75mm 2培养瓶中生长约七天，用等渗溶液洗涤后，用胰酶/EDTA溶液消化，700rpm离心5min，用pH7.4的PBS 重新悬浮，细胞计数板计数，稀释成浓度为210 5cells/ml 细胞悬液。取2.5ml细胞悬液分别加入CS 溶液及CS
30、-NPs溶液，分别进行红外光谱、拉曼光谱及荧光偏振的测定。对于红外光谱的测定，样品于37放置30min后，测定傅立叶变换红外光谱（波数范围4000400 cm -1，分辩率0.5 cm -1） 。 对于拉曼光谱的测定，样品于 37放置2h后，将细胞铺在载玻片自然晾干，进行拉曼光谱测定。对于荧光偏振的测定，首先将分子探针 DPH(1,6-二苯基-1,3,5-己三烯)(1,6-Diphenyl-1,3,5-Hexatriene)用四氢呋喃配制成 1mM 的储备液，避光保存。然后将 2.5l DPH 储备液加入到上述溶液中，37避光放置 30min 后，采用荧光法测定分子探针 DPH 在水平方向和垂
31、直方向的荧光强度，并计算细胞膜的各项异性值 。测定条件：激发波长和发射波长分别为 362nm 和 432nm。此外以胆固醇（25m ）和苯甲醇（ 30mM)作为实验的阳性对照组。苯甲醇能增加细胞膜流动性，DPH 的各项异性值至少降低 6；胆固醇降低细胞膜流动性， DPH 的各向异性值至少增加 2。 9. 基于 SPR 技术实时监测 CS-NPs 及 CS 诱发的 SPR 信号以大鼠 C6 神经胶质瘤细胞(C6 glioma cells)为模型， 将 C6 细胞种植于含10FBS 的低糖 DMEM 的 60ml 培养瓶中，34 天后细胞生长至致密单层，移去培养液，用不完全 DMEM 清洗细胞 2
32、 次，加入 37预热的消化液消化12min，显微镜下观察细胞突起逐渐缩短，细胞逐渐变圆，加入少量 FBS 或含血清 DMEM 中止反应，以吸管轻柔吹打，收集细胞于离心管内，800rpm 离心 6min，弃上清，沉淀重悬于含 10%FBS 的 DMEM，以吸管轻柔吹打，计数细胞浓度，接种于 CCB，置于 37、5%CO 2 培养箱中培养，当细胞生长至90融合时，用 37预热 Hanks 溶液，冲洗反应池 2 次，连接 SBCS 装置并加入 Hanks 至折射率平稳，然后加入 CS 溶液或 CS-NPs 溶液，同时设置无细胞对照组及细胞对照阴性组，观察并记录 RI 变化，建立动态的生物大分子与细胞间相互作用的研究技术。三结果与讨论1. FITC-CS 纳米粒的制备以 FITC 标记的不同脱乙酰度及不同分子量壳聚糖为载体材料，采用离子胶凝法制备壳聚糖纳米粒，其理化性质的结果见表 1。Tab.1 Characteristic of FITC-labeled chitosan nanoparticles of different molecular and degrees of deacetylation（MeanSD, n3）FITC-CS-NPsFITC-chitosan Mean size(nm) poly
