1、一种基于 HIV-1 TAT 蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建 作者：郭爱华；刘志锋；孙学刚；李海玉；邓鹏；姜勇 (南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东 广州 510515)摘要：目的 探索本室构建的 pET14b-His-TAT-Flag 重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因，建立高效的细胞内转导系统。方法 通过 PCR 方法去除原有载体中的 Flag 序列，在改建正确的 pET14b-His-TAT重组载体基础上插入 EGFP 编码序列，将经酶切、DNA 测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP 质粒转化 E. coli BL21
2、(DE3)，经 IPTG 诱导表达、SDS-PaGE 鉴定正确，再经蛋白透析、过滤处理。将 His-TAT-EGFP 融合蛋白加入 ECV304 细胞中，用荧光显微镜观察。结果 重组质粒 pET14b-His-TAT 融合表达载体和 pET14b-His-TAT-EGFP 重组载体经酶切、DNA 测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度 His-TAT-EGFP 融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论 成功改建 pET14b-His-TAT-Flag 重组载体，正确构建 pET14b-His-TAT-EGFP 载体，His-TAT-EGFP 融合蛋白高效表达，并具有明确的细胞内转导活性。关键词
3、：HIV-1 反式激活因子；蛋白质转导结构域；融合蛋白；细胞内转导中图分类号：Q291 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2006)05-0545-04Reconstruction of an intracellular transduction system based on HIV-1 TAT protein transduction domainGUO Ai-hua； LIU Zhi-feng； SUN Xue-gang； LI Hai-yu； DENG Peng； JIANG YongDePartment of Pathophysiology/Key Laboratory
4、of Functional Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, ChinaAbstract: Objective To explore the reasons for the low intracellular transduction efficiency of a previously constructed His-TAT-Flag recombinant protein and establish a more efficient transduction sy
5、stem. Methods The Flag tag of pET14b-His- Tat-Flag vector was deleted with PCR mutant kit, and enhanced green fluorescent protein (EGFP) coding sequence was inserted into the new pET14b-His-TAT recombinant vector. Enzyme digestion and DNA sequencing were performed for identification of pET14b-His-TA
6、T-EGFP vector, which was then transformed into E. coli BL21(DE3). After IPTG induction, the recombinant protein of His-TAT-EGFP was isolated and analyzed with SDS-PaGE. Purified His-TAT-EGFP recombinant protein was added to ECV304 cells and the fluorescence was observed to evaluate the transduction
7、efficiency. Results pET14b-His-TAT vector and pET14b-His-TAT- EGFP vector were successfully constructed, which was identified with enzyme digestion and DNA sequencing. His-TAT-EGFP fusion protein was expressed and purified successfully and showed cellular transduction activity. Conclusion The prokar
8、yotic expression vector has been successfully constructed by modifying pET14b-His-TAT-Flag, and the expressed and purified recombinant protein of His-TAT-EGFP possesses high efficiency of intracellular transduction activity.Key words: human immunodeficiency virus type-1 trans-activator; protein tran
9、sduction domain; recombinant protein; intracellular transduction收稿日期：2005-10-31基金项目：国家高技术研究发展(863)计划课题(2001AA234061)、广东省科技计划项目(A1090202)、广东省自然科学基金重点项目(NO.13058)和广州市科技计划项目(2001-Z-035-01-1)Supported by High-Technology Research Development Program of China (863 Program)(2001AA234061), Sci-Tech Foundati
10、on Project of Guangdong Province(A1090202), Natural Science Foundation of Guangdong Province(13058), and Science and Technology Development Program of Guangzhou MuniciPality(2001-Z-035-01-1)作者简介：郭爱华(1978-)，女，在读博士研究生通讯作者：姜勇，教授，电话：020-61648231, E-mail： 1988 年，Green 和 Frankel 等发现，将人免疫缺陷病毒-1 反式激活因子(HIV-
11、1 TAT)与细胞共同培养时，TAT 能迅速进入细胞，并且发现该蛋白质 3772 位氨基酸残基具有细胞内转导性质1，2。之后的研究发现，TAT 蛋白中第 3772 位氨基酸残基能够穿越细胞膜、转导进入多种类型细胞内3。因此，人们将类似 HIV-1 TAT、能将外源蛋白质转导进入细胞的合成多肽或蛋白质中小的功能域称为蛋白质转导结构域(PTD)。研究证实 HIV-1 TAT PTD 具有广谱的蛋白转导作用4，这一发现开辟了蛋白质跨膜递呈抗原进行免疫治疗的新途径，而且，对于蛋白质和多肽药物转运系统的开发以及蛋白质功能的研究提供了一个有效的手段。Vivce 等发现 TAT 分子中一个富含碱性氨基酸、具
12、有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关5。TAT 蛋白 PTD 的核心序列由 11 个氨基酸组成，序列为 YGRKKRRQRRR，其转导能力与全长 TAT 序列转导能力相当，其特点是转导速度快，效率高。本研究室前期构建的 pET14b-His-TAT-Flag 重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率很低，通过研究证实了 TAT PTD 中多聚阳离子序列在其介导细胞内转导过程中的重要作用，成功地建立了这种高效的细胞内转导系统，从而深化了我们对这一转导系统作用机制的理解。1 材料和方法1.1 材料由 T7 RNA 聚合酶调控的大肠杆菌高效表达质粒 pET-14b-His-TAT-Flag 由本室构建
13、6；大肠杆菌 DH5 菌株以及表达 T7 RNA 聚合酶的大肠杆菌 BL21(DE3)由本室保存；质粒 DNA 提取纯化试剂盒购自日本 Toyobo 公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自 U-gene 公司；DNA 定点突变试剂盒 Mutant BEST Kit 购自 Takara 公司；DNA 重组所用限制性内切酶、T4 连接酶均购自 Toyobo 公司；引物合成在北京三博远志生物技术有限公司进行；DNA序列测定在本室完成； Hela 细胞由本室冻存。1.2 方法1.2.1 pET14b-His-TAT 载体的构建 应用 PCR 点突变技术去除原pET14b-His-TAT-Flag 重组载体中
14、的 Flag 序列。设计一对高特异性引物，上游引物序列为：5-GGTACCCCCGGGCATATGCTCGAGGAT-3；下游引物序列为：5-TCTTCGTCGCTGTCTCCGCTT CTTCCT-3。反应条件为：95 预变性3 min，94 30 s，54 30 s，72 1 min，扩增 30 个循环，再 72 延伸 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物。根据产品说明书，将上述 PCR 反应中回收的目的 DNA 片段行钝化反应，苯酚/氯仿/异戊醇抽提后行乙醇沉淀，加入等量 Ligation Solution I 均匀混合后 16 连接 8 h。连接产物用经典 CaCl2转化法
15、转化感受态大肠杆菌 DH5 ，以氨苄抗性LB 琼脂培养板进行筛选，倒置于 37 孵箱培养 816 h，次日挑取若干单克隆菌落扩增后提取质粒(图 1)，进行 Kpn I 和 Xba I 双酶切鉴定，并进行测序验证。1.2.2 重组载体 pET14b-His-TAT-EGFP 的构建 以 pEGFP-C2 质粒为摸板 PCR 扩增 EGFP 的编码序列，上游引物为：5-AAGGTACCGTG AGCAAGGGCGA GGAGCT-3；下游引物为：5-TAACTCGAGCTAGAT CCGGTGGATCCC GG-3。反应条件为：95 预变性 3 min，94 30 s，53 30 s，72 1 m
16、in，扩增 30 个循环，再 72 延伸 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳回收 EGFP 产物目的片段。用 Kpn I 和 Xho I 对质粒载体pET14b-His-TAT 和 EGFP 目的片段分别进行双酶切。1%琼脂糖凝胶切胶回收载体和目的片段酶切产物。于 16 水浴 8 h 完成连接反应。连接产物用经典 CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌 DH5 ，以氨苄抗性 LB 琼脂培养板进行筛选，倒置于 37 孵箱培养 12 h，次日挑取若干单克隆菌落扩增后提取质粒(图 1)，进行 Kpn I 和 Xho I 双酶切鉴定。对酶切鉴定初步正确的重组质粒进行 DNA 测序鉴定。 图 1 pET14b-
17、His-TAT-EGFP 载体构建流程图Fig.1 Flow chart of the construction of pET14b-His-TAT-EGFP1.2.3 His-TAT-EGFP 细胞内转导方法的建立 将测序正确的pET14b-His-TAT-EGFP 重组质粒转化感受态大肠杆菌 BL21(DE3)，挑取单克隆接种于 5 ml 氨苄抗性 LB 液体培养基，37 ，225 r/min 过夜扩增，次日转入 200 ml 氨苄抗性 LB 液体培养基中扩增至 OD 值约 0.30.4，加入 IPTG(终浓度为 1 mmol/L)，室温 180 r/min 诱导 6 h，4 ，5 000
18、 r/min 离心 10 min，收集细菌沉淀，加入 6 ml 裂解缓冲液(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，将细菌沉淀悬起，于冰上超声破菌，4 ，10 000 r/min 离心 15 min，收集可溶性蛋白上清于离心管中。将收集的蛋白上清过 Ni2+-NTA 亲和树脂柱，用裂解缓冲液洗柱 1 次，含 250 mmol/L 咪唑洗脱液 500 l 洗 3 次，依次收集纯化过程中各步骤流出液，样品行 10% SDS-PaGE 电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定目的蛋白的表达量与纯度。把纯化的 His-TAT-EGFP 融合蛋白在
19、4 透析过夜，透析后的蛋白行过滤除菌。采用 Bradford 法行蛋白定量，80冻存备用。进行蛋白转导实验前 1 d，在 96 孔板中以 1104/孔铺入 ECV304 细胞。次日待细胞融合度达到 60%80%，弃去 96 孔板内细胞原培养基，加入预先混合了 His-TAT-EGFP 融合蛋白(终浓度为 500 nmol/L)的 DMEM 培养基，分别于 15 min 和 3 h 后，吸出培养基，用 PBS 洗 3 次，在荧光显微镜下进行观察。2 结果2.1 重组载体 pET14b-His-TAT 的构建PCR 产物进行 1%琼脂糖电泳，可见一条特异性条带，位于 5 0006 000 bp 之
20、间(图 2A)。pET14b- His-TAT PCR 扩增片段经钝化自连反应后，重组质粒经 Kpn I/Xba I 双酶切，行 2%琼脂糖凝胶电泳，可见切出一条100200 bp 大小的片段，与作为对照的 pET14b-His-TAT-Flag 质粒的平行双酶切结果相比，切出的小片段略小，与预期相符(图 2B)，最后经 DNA测序证实载体构建成功。 图 2 pET14b-His-TAT 载体的构建Fig.2 Construction of pET14b-His-TAT vectorA: Amplification of pET14b-His-TAT fragment by PCR; Lane
21、 1: pET14b-His-TAT PCR fragment; M: 1 kb DNA marker; B: Identification of pET14b-His-TAT with Xba I and Kpn I; Lane 1: pET14b-His-TAT-Flag; Lane 2: pET14b-His-TAT; M: DL2 000 DNA marker.2.2 重组载体 pET14b-His-TAT-EGFP 的构建以 pEGFP-C2 载体为模板， PCR 扩增可见一条约 800 bp 的特异性条带，即为 EGFP 编码序列(图 3A)。重组质粒行 Kpn I 和 Xho I
22、 双酶切，酶切产物用 1%琼脂糖凝胶电泳分离，可见切出一条约 800 bp 特异性条带(图 3B)，DNA 测序证实载体构建成功。 图 3 pET14b-His-TAT-EGFP 载体的构建Fig.3 Construction of pET14b-His-TAT-EGFP recombinant vectorA: Amplification of EGFP coding sequence by PCR; Lane 1: Amplified fragment of EGFP coding sequence; Lane M: 1 kb DNA marker; B: Identification o
23、f pET14b-His-TAT-EGFP with Kpn I and Xho I; Lane 1: pET14b-His-TAT-EGFP recombinant vector; M: 100 bp DNA marker.2.3 His-TAT-EGFP 融合蛋白的原核表达与纯化pET14b-His-TAT-EGFP 质粒转化 BL21(DE3)菌，经 IPTG 诱导后的细菌裂解液在约 33 kD 处出现一条浓集的条带。用 His 亲和树脂层析后也在同样位置有一条高纯度的蛋白条带(图 4)。 图 4 His-TAT-EGFP 融合蛋白的表达与纯化Fig.4 Expression and p
24、urification of His-TAT-EGFP fusion proteinLane 1: Bacterial lysate without IPTG induction; Lane 2: Bacterial lysate with IPTG induction; Lane 3: Ultrasonic lysis supernatant after induction with IPTG; Lane 4: Wash fraction; Lane 5-7: Elute fractions; M: Protein marker2.4 His-TAT-EGFP 融合蛋白的细胞转导向 ECV3
25、04 细胞中加入终浓度为 500 nmol/L His-TAT-EGFP 融合蛋白15 min 后，撤去融合蛋白，用 PBS 漂洗 3 次后，置于荧光显微镜下观察，如图 5B 所示，可以看见视野中沿细胞轮廓分布的强度很高的绿色荧光，接着 3 h 后，如图 5D 所示，可见沿细胞轮廓分布的荧光模式演变为背景均一为暗绿色并上覆点状的荧光颗粒的分布模式。图 5A 和 C 图则分别显示与 B 和 D 相同视野下的可见光细胞形态。由此可见 His-TAT-EGFP 能够在 15 min 内快速进入 ECV304 细胞。 图 5 His-TAT-EGFP 融合蛋白转导进入 ECV304 细胞荧光显微镜观察
26、Fig.5 Observation of intracellular transduction of His-TAT-EGFP recombinant protein into ECV304 cells by fluorescence microscopy (Original magnification: 200)A: Administration of recombinant protein for 15 min (visible light); B: Administration of recombinant protein for 15 min (fluorescence); C: Ad
27、ministration of recombinant protein for 3 h (visible light); D: Administration of recombinant protein for 3 h (fluorescence)3 讨论在目前使用的 pTAT 系列载体中，除了带有 His tag、TAT PTD 和 HA tag 外，尚无任何一个载体将 TAT PTD 序列与 Flag tag 同时毗邻偶连。随着对 TAT PTD 转导系统认识的深入，我们意识到：TAT PTD 序列中富集着在该蛋白转导系统转导活性中被认为具有重要作用的精氨酸残基。精氨酸属于带正电荷的碱性氨
28、基酸，TAT 蛋白 PTD 的核心序列由 11 个氨基酸组成，其序列为 YGRKKRRQRRR。已有报道 TAT PTD 中的 9 个氨基酸序列RKKRRQRRR 就可实现将相对分子质量在 10120 kD 范围内的外源性物质转运到多种不同组织和细胞内，是目前为止所发现的 TAT PTD 最短的序列，其转导能力并不比全长 TAT 序列转导能力差。所以 TAT PTD 蛋白转导系统中多聚阳离子所带的正电荷是关乎其转导活性有无或高低的重要因素。认识到这一点，我们认为找到了可能导致 pET14b- His-TAT-Flag 载体所表达的融合蛋白在细胞内转导效率低的症结所在。因为在这个融合载体中，组成
29、 TAT PTD 的 11 个氨基酸序列与 Flag-tag 序列毗邻，而插入的 Flag-tag 的序列为 DYKDDDDK (Asp-Tyr- Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，其中富含 5 个带负电荷的天冬氨酸。由于 TAT PTD 序列和 Flag-tag 序列位置相毗邻，推测在蛋白表达过程中，发生自身电荷作用互相中和，使 TAT PTD丧失与细胞膜之间静电吸引作用，从而大大降低其蛋白转导活性。改建后载体所表达的融合蛋白能够以进入细胞的终浓度(500 nmol/L)加入细胞培养基 15 min 后，即可被细胞吸收，与文献报道相符7。本部分研究中对 His-TAT-EGF
30、P 融合蛋白采用天然条件纯化，首先基于操作上的简便考虑，为了避免一旦进行变性条件下纯化随之而来的必须在不同尿素浓度梯度下降的透析以及在此过程中产生大量蛋白的沉淀所造成的蛋白丢失。事实证明，在天然条件下得到的 His-TAT-EGFP 融合蛋白具有良好的细胞转导活性，至此，基于 HIV-1 TAT PTD 的细胞转导系统已成功建立。而作为近年来新兴的一门技术，HIV-1 TAT PTD 介导的蛋白转导所具有的跨膜转运大分子的能力在基础医学研究和一些肿瘤性疾病、感染性疾病以及神经系统疾病的治疗研究中已崭露头角，其应用价值已受到广泛的关注。HIV-1 TAT PTD 的应用，无论对于探索基础医学中的
31、理论问题还是解决临床治疗中的实际问题，无疑提供了一个良好的工具8。参考文献：1Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat trans2 activator proteinJ. Cell, 1988, 55(6): 1179-88.2Frankel AD, Pabo C. Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiency virusJ. C
32、ell, 1988, 55(6): 1189-93.3Fawell S, Seery J, Daikh Y, et al. Tat2 mediated delivery of hetero- logous proteins into cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(2): 664-8.4Schwarze SR, Dowdy SF. In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically proteins, compounds and DNAJ. Trends Ph
33、armacol Sci, 2000, 21(2): 45-8.5梁伟,王芹,Dariush D.一个新的 HIV-1 治疗靶-Tat 转录激活蛋白J.生物化学与生物物理进展,2004,31(9):772-6.6Caron NJ, Quenneville SP, Tremblay JP. Endosome disruption enhances the functional nuclear delivery of Tat-fusion proteinsJ. Biochem Biophy Res Comm, 2004, 319(1): 12-20.7Richard JP, Melikov K, Vives E, et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptakeJ. J Biol Chem, 2003, 278(1): 585-90.8FittiPaldi A, Ferrari A, Zoppe M, et al. Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteinsJ. J Biol Chem, 2003, 278(36): 34141-9.
