1、大鼠离体心脏灌注中雌激素对抗同型半胱氨酸诱导损伤的保护性2007 年 8 月第 l7 卷第 8 期中国比较医学杂志CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINEAust,2007V01.17No.8=:盼研究报告$(盼,蛉 e,大鼠离体心脏灌注中雌激素对抗同型半胱氨酸诱导损伤的保护性赵鸿铭,孙静,刘国庆,赵福梅,陈倩,(天津市胸科医院心血管病研究所,天津 300051)【摘要】目的探讨雌激素逆行灌注对大鼠心肌缺血及同型半胱氨酸损伤的快速保护作用.方法先行结扎前降支,心肌缺血 1015min,然后再行灌注 1h,建立心肌缺血.再灌注模型.实验中分为 KH 液组(c 组);
2、雌激素组(E 组);同型半胱氨酸组(H 组);同型半胱氨酸+雌激素组 (HE 组).分别在结扎前,结扎后,再灌 5,10,20,4o,60min 心脏接取流出液测量心肌酶等.结果除对照组外,其他 3 组差异均显着.结论短时间应用雌激素对心肌酶的下降无明显影响,可以减低离体心脏的心律增加冠脉流量,雌激素同型半胱氨酸对一氧化氮合酶的表达无明显影响,对缺血部位心肌中血管紧张素的含量无明显影响.【关键词】大鼠;离体心脏;缺血.再灌注;内皮型一氧化氮合酶; 血管紧张素 I/;内皮素【中图分类号】R.33【文献标识码】A【文章编号 】1671.7856(2007)08.S1603流行病学调查表明,冠心病的
3、发病率在男性和绝经前女性之间存在明显的性别差异.男性的发病是女性的 310 倍,女性绝经后这一差异逐渐消失,由此认为雌激素可能与冠心病的防治有一定的关系.有证据表明雌激素对血管壁有直接的保护作用.目前已证实同型半胱氨酸是人群心脑疾病发病的独立危险因子,他可能通过损害内皮功能激活血小板,诱导平滑肌细胞增值.促脂质过氧化以及增加肝细胞合成途径诱导动脉粥样硬化病变的发生.而雌激素抗动脉粥样硬化的作用点也在保护血管内皮细胞,抑制平滑肌细胞增殖,降低血脂,抗氧化等方面.本实验以大鼠离体心脏为缺血再灌注模型,采用体外给药的方法,在灌流液中分别加入同型半胱氨酸;雌激素或联合使用两种药物,旨在观察雌激素对心肌
4、缺血.再灌注损伤的保护;同型半胱氨酸对心肌缺血一再灌注的损伤;以及雌激素对同型半胱氨酸诱导损伤的快速保护作用.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 动物:雄性 16 周龄 Wismr 大鼠,体重 30025g(购自军事医学科学院动物中心),合格证号:0006194.1.1.2 仪器与试剂:水溶性 17 一 p 雌二醇(17 一estradiolwator-soluble,E2,Sigama 公司);同型半胱氨酸(homocysteine,Hey,Sigma 公司);K H 液的成分(mmol/L):Nacl18;KCI4.7;KH2PO40.93;MgSo41.2;CaCI21.5;NaHCO
5、325;C6Hl2O611;血管紧张素(angiotensinII,AngII);内皮素(endothelin,ET); 放射免疫测定盒(北方生物技术研究所);Langendorff 离体心脏逆行灌注装置;储气瓶,95%氧+5%二氧化碳(天津伯克氧气有限公司);RM6240 生物信号采集系统(成都仪器厂);ZF 型紫外透射反射仪(上海华康生化仪器厂制造);恒温电热水器.1.2 方法1.2.1 离体心脏缺血一再灌注模型的制作:动物称体重;乙醚吸入麻醉后拉颈处死;固定在手术台上.常规取出心脏,置于 4cI=含有肝素的 KH 液中.清理周围组织,行主动脉插管后即固定在灌流架上进行逆性灌流.灌流液中事
6、先充以 95%O+5%CO气体.灌注压 60mmHg 灌流 15min,此时 KH 灌注【作者简介】赵鸿铭,男,副研究员,主要研究方向:循环系统体外灌流病理 ,生理研究.中国比较医学杂志 2007 年 8 月第 l7 卷第 8 期ChinJCompMed,August2007,Vo1.17.No.8Sl7液逐渐升温至 37cI=,整个灌注过程中均为逆行,恒温,恒压.心电示波仪监测心率和心律.以 5 个 0无损伤缝线在左心耳与肺动脉圆锥之间穿过前降支,结扎缝线使心肌缺血 l015min 后剪断结扎线;再行灌注 lh,记录灌注液的温度;离体心脏的心率及冠脉流量;并留取相同时间段的灌流液测定心肌酶.
7、灌流完成后剪取缺血部位的心肌组织约 30mg加 PIJT 裂解液匀浆,准备提取 RNA.另取缺血部位的心肌组织 50mg 加 5%PDS500ttL 匀浆一 20cI=保存,准备测量心肌组织中的血管紧张素 II(angiotensionII,AngII)取缺血部位的心肌组织约80mg 加生理盐水 400ttL,匀浆;一 20cI=冻存待测量心肌中的内皮素(endothelin,ET)的浓度.1.2.2 灌流及结扎:对照组(C 组):KH 灌流液逆行灌流 1015min;结扎前降支(122)min,减断结扎线再灌流 lh.雌激素组(E 组):KH 液中加10mol/L 的水溶性 l7B.雌二醇方
8、法同 C 组.同型半胱氨酸(H 组):KH 液中加 10mol/L 的同型半胱氨酸,方法同 C 组.雌激素组+同型半胱氨酸组(HE组):K H 液中加 10mol/L 的水溶性 l7B 一雌二醇和.10-4mol/L 同型半胱氨酸,方法同 C 组.提取心肌总RNA.逆转录.聚合酶链反应(PCR).测定心肌中AngII,ET 浓度.分析电泳图像.2 结果2.1 离体心脏缺血.再灌注不同时间段的心肌酶本实验选择肌酸激酶同工酶(CKMB)作为心肌酶的代表.各不同时间段的心肌酶(CKMB)水平比较见表 l.表 1 各实验组大鼠不同时间段的心肌酶(CK.MB)比较(U/L)Tab.1Comparison
9、ofcardiacenzymesCK.MGandU/LinratofdifferentgroupsC 组 E 组 H 组 HE 组事前 39.6o+l1.9741.87:l1.1o28.00=22.1435.62=6.69IJeloten,atlon前毒时 83.25=29.1880.00=24.2980.57=25.8488.50=32.24l/urlngngatlon?min.I(B.O0=42.14100-衢-31.135.63=28.94114.75=14.27“epertusl 彻,3niln再灌注 10min79.75:34.6366.28:15.1493.62:21.638280
10、:3237再灌注加 nRepedusion,51.75=27.61 研 .43=10.3760.28=36.岱 61.=24.69min心肌酶的峰值在各实验组均出现于再灌后 5min 时,再灌后 E 组心肌酶下降稍快于其它各组.H组再灌 5min 后心肌酶与对照组比有所升高,但差异无显着性,P0.05.2.2 内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的基因表达用半定量的方法比较各实验组大鼠缺血心肌再灌后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达差异无显着性,见表 2.表 2 各实验组大鼠不同时间段的心率比较(次,分)Tab.2Comparisonofheartrateinratsofdifferentgrou
11、ps(times/min)2.3 血管紧张素受体 2 的基因表达以 RT-PCR 的方法观察各实验组大鼠缺血心肌再灌后血管紧张素受体 2 的基因表达差异无显着性.2.4 心肌中血管紧张素 ll(angiotensin,Ang).内皮素(endothelin.ET)含量各组大鼠心肌中的 AngII 水平差异无显着性(P0.05),E 组心肌 AngII 水平稍低于其他组.E组心肌中 ET 含量显着低于其他各组,差异有显着性(P0.05).H 组心肌中 ET 含量明显高于其他组,差异有显着性(P0.01).C 组和 HE 组比较差异无显着性(P0.05).3 讨论3.1 离体心脏灌注模型制备的体会
12、(1)主动脉插管不能插入太深,以免阻塞冠脉入口和损伤主动脉瓣,造成瓣膜关闭不全.(2)在整个灌流过程中始终保持心脏灌流液和心脏周围的温度为 37oC0.5oC.(3)灌注前灌流液事先要充以 95%的 O 和 5%的 c0,要使 pH 维持在 7.387.46;灌注压 60mmHg 灌注液中只充氧则难以控制pH.3.2 同型半胱氨酸对离体心脏的影响目前有关同型半胱氨酸与心血管疾病的关系的Sl8 中国比较医学杂志 2OO7 年 8 月第 l7 卷第 8 期ChinJCompMed,August2007,Vo1.17.No?8研究多集中在临床和动物实验中 l,我们采用离体心脏模型探讨同型半胱氨酸快速
13、损伤对这些指标的影响.3.2.1 同型半胱氨酸对缺血心肌 eNoS,AT2 基因表达的影响:发现 H 组的 eNoS 表达略有下降,无统计学意义,与他人文献结果相似.可能是同型半胱氨酸作用时间过短或实验例数过少的原因,今后可延长作用时间或增加实验例数做进一步的研究.3.2.2 同型半胱氨酸对于心肌中血管紧张素 II,内皮素的影响:H 组的血管紧张素 II 与对照组相比含量相似.各实验组的血管紧张素 II 的水平差异无显着性,P0.05. 可能在快速刺激情况下,同型半胱氨酸并不能刺激平滑肌细胞分泌血管紧张素.同型半胱氨酸组的内皮素水平较其它实验组显着增加,P0.05. 内皮素具有强烈的缩血管作用
14、 ,可以引起冠脉的收缩,本实验显示短期同型半胱氨酸刺激可引起组织内皮素水平的升高.3.2.3 雌激素对心血管的保护作用 J:3.2.3.1 对缺血再灌注后 CK.MB 活性的影响:E 组的心肌酶(CK.MB)的降低稍快于其他各组.再灌20min 时 CK.MB 含量明显低于对照组.H 组心肌酶(CK.MB)的峰值高于其他各组,但差异无显着性,P0.05.3.2.3.2 对离体心脏心率,灌脉流量的影响 J:在实验 1.5h 的时间内使用雌激素可以减低心率,增加灌脉流量与其它结果相吻合“.3.2.3.3 对内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响 l 引:本实验首先制备离体心脏缺血再灌模型,而后分别给予离
15、体心脏含有的 K.H 灌注液 1.5h,以 RT-PCR 的方法观察 eNOS 的表达.结果在 E组的 eNOS 基因表达高于对照组,但无统计学意义.可能由于统计时间短尚未对 eNOS 的基因表达产生影响.3.2.3.4 对 AT2 基因表.达的影响:在本实验中AT2 雌激素对基因表达无影响,可能是缺血再灌注后 AT2 的基因表达尚未出现变化,而且,雌基素对于心血管的保护作用可能并不通过 AT,受体图径,或者也是由于雌激素作用作用时间过短的缘故.3.2.3.5 对心肌中血管紧张素 II,内皮素水平的影响 l“:本实验中雌激素组的内皮素水平显着高于其他各组,差异有显着性 P0.05.3.3 雌激
16、素对同型半胱氨酸损伤的保护“本实验证明雌激素减低离体心脏的心率,增加其冠脉流量,降低组织中内皮素的水平;而同型半胱氨酸增加离体心脏的心率,减低其冠脉流量,增加组织中内皮素的水平.雌激素与同型半胱氨酸同时使用,可以使上述指标恢复到对照组水平.由此可以推测雌激素对于同型半胱氨酸介导的快速损伤具有保护作用.本实验因实验例数少,雌激素作用时间过短,观察内容尚少,结论内容有很大的局限性.参考文献:SongYS,RosenfeldME.Methiunine-inducedhyperhonmeysteinemiapmmotessuperoxideaniongenerationandNFkappaBperit
17、onealmacrophagesofC57BL/6miceJ.JMedFood,2004,7:229234.ZhangXH,HongLiH,JinHL.EffectsofhomneysteineonendothelialnitricoxideproductionJ.AmJPhysiolRenalPhysiol,20【)o.279(4):F67lF678.YoshiyamaM,KimS,YamagishiH,eta1.CardioprotectiveeffectofAngIItypelantagonistTCV2116onisehemia-repefusioninjury【JJ.AmHeartJ
18、,1994,l28(1):l26.ZHaip.eta1.Effectsofdietaryphytoestrogenonglobalmyocardialisehemia-reperfusioninjuryinisolatedfemaleratheartsJ.AmJphysiolHeartCircPhysiol2001,281(3):H1223 一 HI232.RaddinoR,MancaC.PDliE,eta1.Effectsof17-betaestrediolontheisolatedrabbitheart.ArchIntPharmacedyn1986.281:5765.JiangC,Sarr
19、elPM,Poole-WilsonPA.eta1.Acuteeffetof17beta-estradiolonrabbitcoronaryayterycontractileresponsestoendothelin-1.AmJPhysiol.l992.263:H27l 一 275.StefanoCB,PrevotV,BeauvillainJC,eta1.Cell-sutsregenreceptorsmediatecalcium-dependentnitricoxidereleaseinhumanendothelia【JJ.Circulation,20【)o,101:l594 一 l597.Wh
20、iteCR,Darley-UsmarV.OparilS.NoroleforNOinestrogen-mediatedvasoprotnetion【JJ?Cireulation,l997,96:2769 2771.KrasinekiK,SpyridopoulosI.AsaharaT.EstradiolacceleratesfunctionalendothelialrecoveryafterarterialinjuryJ.Circulation.l997.95:17681772.YangBC,PhillpsMI,AmbueldPE,eta1.IncreseinangiotensinIItypelr
21、eceptorexpressioniannediatelyafterisehemia-repedusioninisolatedratheartsJ.Cireulation,l997.96(3):922926.LeeTM,ChouTF,CH,eta1.DifferentialroleofKrPchannelsactivatedbyconjugatedestrogensintheregulationofmyocardialandprotectiveeffectsJ.Ciculation,2003,107(1):4954.KimMH.KimE,PassenEL.eta1.Lortisol:nongeneticfactorsforhyperhomneysteinmla.J.Metabolism,1997,46(2):247249.r 修回日期2oo7-o6-2o1Jr=纠引
