1、正清风痛宁治疗类风湿关节炎 临床与作用机制研究,国家中医药管理局重点中西医结合风湿病专科 第三军医大学西南医院风湿病诊疗中心 方勇飞,正清风痛宁有效成份为盐酸青藤碱 以青风藤为原料提取 本草纲目称青风藤“主治风疾，风湿流注，历节鹤膝” 本草汇言记载：“青风藤散风寒湿痹之药也，能舒筋活血，久服必大建奇功” 。,青藤碱的特性,青藤碱(sinomenine,SN)是从青风藤根茎中分离提取的一种单体生物碱。 药用多为其盐酸盐，分子式C19H23NO4，分子量329.38。 从化学结构上看，由氢菲核和乙胺桥组成，结构类似吗啡,青藤碱抗炎抑制免疫的机制研究,国家自然科学基金（30300452）、重庆市中医
2、药基金（2003C77）及正清基金资助,本项目研究目标,与氨甲喋呤（MTX）相比较，初步探讨SN对胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠的关节积分，IFN-，抗型胶原抗体的影响初步探讨SN对佐剂性关节炎（AA）及CIA大鼠滑膜细胞表达与分泌IL-1、TNF-、IL-10的影响；从NF-B信号通路中相关环节来探讨其具体的抗炎机制及可能的量效关系,研 究 方 法,本研究分三部分 第一部分：建立CIA小鼠关节炎模型，行关节评分；夹心ELISA法检测脾细胞分泌IFN-的能力；间接ELISA法检测血清中抗型胶原抗体的水平，同时与MTX相比较 第二部分：建立AA及CIA大鼠模型，分离培养大鼠双膝滑膜细胞，运用反转
3、录-PCR检测IL-1、TNF-、IL-10的mRNA表达、EMSA检测NF-B的DNA结合活性、免疫印迹检测IB-的表达，间接免疫荧光法检测P65的核转位情况 第三部分：临床研究：ELISA检测RA中IL-1、TNF-、IL-10及CCP抗体经SN或MTX治疗前后的变化,第一部分 研究结果,正常DBA/1小鼠关节正常（A），其后爪的H&E染色表明无明显的炎细胞浸润（C）。而牛II型胶原可诱发DBA/1小鼠出现关节肿胀、屈曲等关节炎症（B），其后爪的HE染色表明有明显的炎细胞浸润（D）。 HE x 200,建立牛II型胶原诱发DBA/1小鼠关节炎模型,治疗分组,A.正常小鼠对照组 B.CIA：
4、生理盐水治疗组(阴性对照组) C.CIA：MTX 0.4mg/kgw治疗组(阳性对照组) D.CIA：MTX 0.4mg/kgw + SN 7.5mg/kgd治疗组 E.CIA：SN 7.5mg/kgd治疗组 F.CIA：SN 15mg/kgd治疗组,正常对照组小鼠未出现关节炎性改变，其他各组均有不同程度的关节炎症表现。从初次免疫后第28天起，MTX组、MTX+SN组、SN小剂量组、SN大剂量组小鼠关节评分均低于对照组。其中，MTX+SN组关节评分最低,不同治疗组小鼠脾淋巴细胞体外刺激后分泌IFN-水平,生理盐水对照组IFN水平明显高于正常对照组(P0.05)；各治疗组IFN水平均低于生理盐水
5、对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两单个SN治疗组均高于MTX组,生理盐水对照组抗型胶原抗体水平高于正常对照组(1:10和1:100两个稀释水平P0.05)；各治疗组中抗型胶原抗体水平均低于生理盐水对照组，其中以MTX+SN治疗组最低，而两个SN治疗组均高于MTX组，与生理盐水对照组无显著差异,第一部分初步结论,无论大剂量还是小剂量应用SN治疗CIA，其改善炎症症状、抑制IFN和抗型胶原抗体的能力均不及经典抗风湿药物-MTX但SN与MTX联合治疗CIA优于其它SN或MTX单独使用的治疗方案,第二部分 研究结果,胶原诱导型关节炎大鼠模型建立,正常对照大鼠,CIA模型大鼠,正常大鼠与胶原诱导
6、性关节炎大鼠 后肢踝关节滑膜病理图片,正常大鼠（HE x400）,CIA大鼠（HE x400）,滑膜细胞的培养和鉴定,(倒置相差显微镜 x100),(倒置相差显微镜 x200),滑膜细胞的培养和鉴定,传代培养的大鼠滑膜细胞电镜图片(透射电镜 x4000),不同浓度SN对AA大鼠滑膜细胞表达TNF-、IL-1及IL-10mRNA的影响,RT-PCR图像显示，正常对照组滑膜细胞均有较弱的TNF-mRNA、IL-1mRNA及IL-10mRNA的表达，而这三种细胞因子在AA大鼠的表达较正常对照组均明显升高（P0.05） 随着青藤碱的体外剂量浓度逐渐从30g/ml增加至120g/ml时，TNF-mRNA
7、、IL-1mRNA的表达呈浓度依赖性地下降，而IL-10mRNA的表达亦呈下降趋势，但无浓度依赖性,大鼠滑膜细胞TNF-mRNA、IL-1mRNA的表达,TNF-,IL-1,Control,AA,SIN30g/ml,SIN60g/ml,SIN120g/ml,Marker,大鼠滑膜细胞IL-10 mRNA的表达,IL-10,-actin,Contrl,AA,SIN30g/ml,SIN60g/ml,SIN120g/ml,Marker,不同剂量SN对AA大鼠滑膜细胞内NF-B活性的影响,AA大鼠滑膜细胞内NF-B的活性较正常对照组明显活化。SN从30g/ml至120g/ml可浓度依赖性地抑制NF-B
8、活性经SN作用后，NF-B活性的变化趋势与TNF-mRNA、IL-1mRNA的相关性较好（r=0.810,P0.05）,核转录因子的检测用EMSA法，并用竞争性试验证实其特异性,NC,PC,NSC,SC100,SC200,SN对AA大鼠滑膜细胞NF-B活性的影响,lane1,lane2,lane3,lane4,lane5,lane6,Lane 1 NC; lane 2 contrl; lane 3 AA; lane 4 AA+ SN 30g/ml;lane 5,AA + SN 60g/ml; lane 6, AA+ SN 120g/ml.,SN对AA大鼠滑膜细胞IB-表达的影响,lane1,l
9、ane2,lane3,lane4,lane5,lane 1 contrl; lane 1 AA; lane 3 AA+ SN 30g/ml;lane 4,AA + SN 60g/ml; lane 5, AA+ SN 120g/ml.,SN对关节炎大鼠滑膜细胞P65核转位的影响,正常对照,关节炎,PDTC阳性对照组,50uM SN,500uM SN,细胞NF-B信号通路的调控作用,第二部分初步结论,SN通过抑制NF-B活性及IB-的降解而呈浓度依赖性地下调关节炎大鼠滑膜细胞内TNF- mRNA、IL-1 mRNA的表达 SN对关节炎大鼠滑膜细胞内IL-10 mRNA的表达亦呈下降趋势，但无浓度依
10、赖性 SN可呈浓度依赖性地抑制关节炎大鼠滑膜细胞P65的核转位,第三部分 研究结果,SN或MTX对RA患者血清TNF、IL-10及CCP抗体的影响,SN或MTX对RA患者血清TNF-a、IL-1、IL-10及CCP抗体的影响,与正常对照组相比，RA患者血清中TNF-含量明显增加，CCP抗体的相对滴度显著增高（P0.05） SN或MTX在治疗后1月及2月时均能显著降低RA患者血清中TNF-的含量（P0.05） RA患者有较高的IL-1的表达， SN或MTX在治疗1月及2月后IL-1beta的含量明显降低（低至无法检测出，未用图表显示） SN可通过降低RA患者中TNF- 、 IL-1 的含量而治疗
11、类风湿关节炎,青藤碱对类风湿关节炎患者滑膜细胞 凋亡的影响及机制的研究,重庆市中医药基金（2003C77）、正清基金资助,本项目研究目标,初步探讨SN对RA患者滑膜细胞的致凋亡及抑制增殖作用进一步探讨SN对RA患者滑膜细胞凋亡蛋白Bcl-2表达及细胞周期的影响，以了解其诱导凋亡的相关机制,研 究 内 容,收集RA患者滑膜组织（由我院关节外科中心提供），培养滑膜细胞，观察滑膜细胞形态，并测定其生长曲线凋亡效应的研究：SN对滑膜细胞增殖的抑制及致凋亡作用凋亡机制的研究：凋亡蛋白Bcl-2的表达及滑膜细胞周期的变化,滑膜细胞形态成纤维样滑膜细胞光镜下的结构40 光镜下见呈梭形或柱形，细胞核呈卵圆形，
12、位于细胞中央，核仁明显,滑膜细胞生长曲线,RA滑膜细胞接种后第7天数量达到高峰,滑膜细胞凋亡效应的研究,一、MTT法检测SN对RA滑膜细胞的增殖抑制作用,滑膜细胞加药处理后OD值均明显低于于未加药组（P0.01,n=5）,二、光镜下RA滑膜细胞凋亡形态,加药后部分细胞由贴壁脱落而呈悬浮生长，贴壁能力减弱，细胞形态变圆，体积缩小，核固缩出现。3.2mmol/LSN作用48h组尤为明显。不含药培养液培养的对照组细胞贴壁生长，几乎无脱落，胞浆饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片RA滑膜细胞光镜下的结构 40 3.2mmol/LSN作用滑膜细胞48h 40,三、荧光显微镜下RA滑膜细胞凋亡形态,荧光显
13、微镜下见正常对照组细胞核较大，呈均匀弥散荧光；处理组细胞出现典型的凋 亡核形态学改变，表现为核体积缩小，大小不一，染色不均匀，呈致密浓染的颗粒或 块状增强荧光正常滑膜细胞核（200）青藤碱终浓度2.8mmol/L（200）12小时 24小时 48小时,青藤碱终浓度3.0mmol/L（200）12小时 24小时 48小时青藤碱终浓度3.2mmol/L（200）12小时 24小时 48小时,四、流式细胞仪检测滑膜细胞凋亡率,滑膜细胞加药处理后凋亡细胞百分率均明显高于未加药组（P0.05,n=5）,结 果,MTT法显示2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L的SN作用24、48 h
14、能够抑制滑膜细胞增殖，其中以3.2mmol/L作用48h最明显光镜、荧光显微镜下发现2.8mmol/L、3.0mmol/L、3.2mmol/L的SN分别作用后滑膜细胞出现凋亡表现，如细胞变圆、胞体皱缩、细胞核荧光染色增强等不同浓度的SN分别作用于滑膜细胞，凋亡率呈浓度依赖性，与对照组比较有显著差异(P0.05)，其中3.2mmol/L浓度的SN作用48h对滑膜细胞凋亡影响最为显著,滑膜细胞凋亡机制的研究,一、SN对RA滑膜细胞周期时相分布的影响,不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G0/G1期的影响（xs，n=5） SN（mmol/L） G0/G1（） t P正常对照 85.98600.812
15、5 2.8 88.13401.5070 2.743 P=0.0230.053.0 89.64603.1585 2.509 P=0.0360.053.2 92.09001.6589 7.389 P=0.0000.01不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对S期的影响（xs，n=5）SN（mmol/L） S（） t P 正常对照 0.8540.6172 2.8 1.20400.4202 1.048 P=0.3250.053.0 1.18400.6744 0.807 P=0.4430.053.2 1.11800.4437 0.777 P=0.4600.05,不同浓度SN作用RA滑膜细胞48h对G2/M期
16、的影响（xs，n=5）SN（mmol/L） G2/M（） t P正常对照 13.16201.2309 2.8 10.66401.2241 3.218 P=0.0120.05 3.0 9.17602.7400 2.967 P=0.0180.05 3.2 6.79001.8416 6.432 P=0.0000.01 不同浓度SN对RA滑膜细胞作用48h，实验结果表明G0/G1期的细胞百分比逐渐增加（P0.05）；S期细胞百分比无明显变化；G2/M期比例显著减少（P0.05）,二、Bcl-2蛋白表达水平的变化,经流式细胞仪检测Bcl-2蛋白的表达随药物浓度的增加而下降,（注：*与对照组比较P0.01
17、）,结 论,1.SN可诱导RA患者滑膜细胞凋亡 2.SN阻滞G1期细胞向S期移行，并下调Bcl-2基因的表达，这可能是SN诱导RA滑膜细胞凋亡机制之一,盐酸青藤碱对类风湿关节炎患者 CD28/CTLA-4表达的影响,辅助刺激分子CD28/CTLA-4在RA中的表达及临床相关性研究,实验方法：,32例RA患者外周血和16例双关节积液 流式细胞学技术Spearman相关分析,结 果,CD3+CD28+ /CD3+CTLA-4+在RA病人PBMC上的表达,CD3+CD28+/CD3+CTLA-4+在RA病人SFMC上的表达,RA患者PBMC和SFMC上CD3+CD28+和 CD3+CTLA-4+的表
18、达,CD28/CTLA-4分子与RA病人ESR、RF 和抗CCP的相关关系,* P0.05,CD28/CTLA-4分子与RA病人晨僵时间、关节肿胀指数、压痛指数、总体平分的相关性,* P0.05,讨 论,CD3+CD28+ 、CD3+CTLA-4+的表达在RA-PBMC、RA-SFMC和正常人PBMC上有差异； 通过Spearman相关分析发现上述差异与RA的临床活动性存在着一定的相关关系，提示CD28/CTLA-4是RA病情进展的影响因素之一，但并非决定性因素。,盐酸青藤碱对类风湿关节炎患者 CD28/CTLA-4表达的影响,实验方法：,流式细胞术双标染色技术：采用全血直标法检测经SN治疗前
19、后RA病人PBMC上CD3+CD28+和CD3+CTLA-4+的表达。,结 果,治疗前,治疗后,RA病人经SN治疗2月后PBMC上 CD28/CTLA-4的变化,* P0.05,SN上调了T细胞上CTLA-4的表达后，更多的负性信号抑制了T细胞活化或诱导了T细胞的失能(Anergy)，从而抑制RA患者体内T细胞活化反应.,正清风痛宁治疗RA的作用机制,RA是免疫介导的炎症性疾病 滑膜组织中的巨噬细胞、成纤维样滑膜细胞、T细胞产生大量的前炎症性细胞因子如IL-1、TNF-、IL-6、IL-17等，促进了破骨细胞的分化与激活，在RA的关节破坏中起重要作用。 抑制滑膜内衬巨噬细胞样细胞TNF-合成
20、减少滑膜细胞IL-6mRNA的表达 降低血清内IL-1、TNF-水平 下调人外周血单个核细胞IL-1、IL-6mRNA表达,抗炎免疫抑制,正清风痛宁治疗RA的作用机制,IL-4、IL-10可通过抑制Th1细胞介质导的免疫应答，并抑制IL-6、TNF-等炎性细胞因子的功能和生成，从而达到抗炎目的。 SN能使佐剂性关节炎大鼠血清及关节浸液内IL-1，TNF水 平显著降低， IL-4及IL-10水平显著增高，从而抑制细胞因子的促炎效应，增强细胞因子的抗炎效应,正清风痛宁治疗RA的作用机制,RA患者关节滑膜组织内环氧化酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮 合酶(iNOS)过度表达，其诱导产物PGE2、
21、NO大量合成，引起炎 细胞浸润、滑膜组织异常增生、新生血管翳形成，导致关节肿胀 、退变 。 SN抑制COX-2活性的同时，较强地抑制了PGE2的合成 动物实验上，SN对大鼠佐剂性关节炎继发病变显著抑制，且关节浸液NO，PGE2水平显著降低,正清风痛宁治疗RA的作用机制,RA存在着NF-B持续的激活，促进RA滑膜细胞的大量增生，导致血管翳的形成。因此抑制NF-B的过度活化很可能成为治疗RA较好的方法 SN可能通过下调单核/巨噬细胞核转录因子-B(NF-B )的活性，干预NF-B信号通路的某些环节，抑制细胞因子TNF-mRNA、IL-1mRNA及IL-10mRNA的表达及分泌，而产生抗炎作用,正清
22、风痛宁治疗RA的作用机制,SN通过影响钙离子依赖的T细胞活化信号传导途径从而显著降低T细胞内细胞因子IFN-、TNF-分子的表达 SN能显著抑制CD4+T细胞的增殖，使细胞周期停滞在G0/G1期 SN可能通过阻断NF-B信号通路，抑制树突状细胞激活T细胞的能力 SN可能通过抑制DCTLRs的表达，阻断了TLRs信号转导途径介导的DC成熟和细胞因子的分泌，间接阻止了T细胞的异常活化,阻止T细胞异常活化,正清风痛宁治疗RA的作用机制,lOM-lmM的SN对于体外培养的人RA滑膜细胞增殖有直接抑制作用 SN可通过下调突变型P53来抑制滑膜细胞增生和诱导细胞,最终减轻CIA大鼠的关节炎症状 不同剂量的
23、SN诱导RA滑膜细胞凋亡，并在一定浓度及作用时间内可通过阻滞G1期细胞向S期移行及下调Bcl-2基因的表达而抑制RA患者滑膜细胞增殖，诱导凋亡,对滑膜细胞增殖及凋亡的影响,正清风痛宁治疗RA的临床研究,（一）单药治疗,杨小恒等采用正清风痛宁治疗类风湿性关节炎118例，总有效率为91.52%，副作用小谌曦等运用正清风痛宁治疗类风湿性关节炎，对患者四肢功能、关节晨僵时间、关节疼数、血沉及类风湿因子的改进均较显著，且副作用较小,正清风痛宁治疗RA的临床研究,正清风痛宁与MTX、萘普生、泼尼松、柳氮磺吡啶联合应用治疗RA，病人的血沉、晨僵时间、关节肿痛、压痛、关节活动度、日常生活能力，均有明显的改善与好转，且疗效优于单纯西药组，副作用也轻微，安全性也较好 正清风痛宁缓释片联合MTX治疗RA，总有效率与单独应用MTX相仿，而不良反应少 来氟米特与甲氨喋呤联合正清风痛宁治疗类风湿性关节炎疗效优于来氟米特与甲氨喋呤两药联合,（二）联合用药,几点体会,正清风痛宁的定位：抗炎?、镇痛?、DMARDs（UA，维持长期缓解） 关节腔注射浓度 副反应： 皮疹（较早期减少） 血糖升高（罕见） 血小板减少、白细胞减少（可能亦为其疗效机制） 如何走向世界（唯一单体抗风湿中药）,73,谢谢！,74,谢谢,
