1、细胞生物学研究方法,细胞生物学研究方法,进行初步观察,形成可验证的假说,设计试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已 有知识,生物学研究模式生物是基于 不同物种享有共同分子机制,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,Arabidopsis thaliana,第三章 细胞生物学研究方法,第一节 细胞形态结构的观察方法,1 光学显微镜技术（light microscopy）2 电子显微镜技术 (Electro microscopy)3 扫描遂道显微镜 (scanning tunnelingmicroscope ),一、光学显微镜技术（l
2、ight microscopy),普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）相差显微镜（phase-contrast microscope）（自习）,普通复式光学显微镜技术,分辨率是指区分开两个质点间的最小距离,普通光学显微镜,各种显微镜的分辨率梯度,荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）,原理,荧光显微镜技术 （Fluorescence Microscopy）,应用直接荧光标记技术间接荧光标记技术(免疫荧光标记技术)用于特异蛋白
3、质等生物大分子的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,应用：绿色荧光蛋白,激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）,原理： 应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，通过“光切片”观察样品内部结构，可重构样品的三维结构。,激光共焦扫描显微系统(Confocal System),Pine Tree pollen - collected on a Bio-Rad MRC 1024 at Purdue University Cytometry Laboratories,利用光切片技术显示的花粉内部结构,1为转
4、GFP基因的烟草单细胞；2为转SCaM1-GFP融合基因的烟草单细胞；3为转SCaM4-GFP融合基因的烟草单细胞。,质壁分离后转基因烟草单细胞的激光共聚焦显微镜观察,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞壁,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞膜,细胞核,细胞核,细胞膜,细胞壁,细胞核,细胞膜,二、 电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电子显微镜的基本构造,电镜与光镜的比较,电子显微镜的基本构造,电子束照明系统、成像系统、真空系统、记录系统,二、 电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术,主要电
5、镜制样技术,超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 细胞超微结构 负染色技术（Negative staining）染色背景，衬托出样品的精细结构，如病毒、核糖体等结构。 冷冻蚀刻技术（Freeze etching）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 电镜三维重构技术电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,固定 包埋 切片 染色,超薄切片技术,超薄切片技术图片示例,冷冻蚀刻,二、 电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识电镜与光镜
6、的比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术负染色技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术电镜三维重构技术扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）,扫描电镜,原理与应用：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题,三、 扫描遂道显微镜,Scanning Tunneling Microscope,STM80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器。反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 特点：分辨率高：侧分辨率：分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.001nm 不受介质限
7、制 非破坏性 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构，观察生物大分子、膜、病毒等的结构。,2. 特异蛋白抗原的定位与定性,3. 细胞内特异核酸的定位与定性,4. 放射自显影技术,1. 离心分离技术,第二节 细胞组分的分析方法,一、 离心分离技术,用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离,差速离心,密度梯度离心常用的介质：蔗糖、氯化铯、甘油等。,二、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限免疫电镜技术免疫胶体金技术 应用：能对蛋白进行精细定位。如通过对分泌蛋白的定
8、位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot),免疫荧光技术图片示例,免疫胶体金技术原理与图片示例,三、细胞内特异核酸的定位与定性,光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）,四、放射自显影技术,原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。,第三节 细胞培养、细胞工程,1 细胞的培养2 细胞工程,与显微操作技术,一、细胞的培
9、养,动物细胞培养 类型：原代培养细胞（primary culture cell）传代培养细胞（sub-culture cell）细胞株（cell strain） 正常二倍体，具有接触抑制。细胞系（cell line）染色体改变，接触抑制丧失，无限传代 植物细胞培养 非细胞体系（cell-free system） 研究DNA复制、蛋白质合成等生命活动,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,二、细胞工程,细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（cell hybridization）技术 单克隆抗体技术 细胞拆合与显微镜操作技术 转基因动物与转基因植物,细胞融合：同核细胞融合异核细胞融合,单克隆抗体技术,物理法结合显微操作技术(图示)化学法结合离心技术制备核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）。,细胞拆合与显微操作技术,显微操作显微镜,对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈,细胞生命活动,突变体分析,突变体分析,蛋白修饰分析,基因表达,多肽定性分析,生物信息学,序列测定,双向电泳分析,DNA分离与克隆,机器人技术(robotics),功能基因组学,蛋白质分离与制备,蛋白质组学,
