1、氨基酸修饰大孔吸附树脂 NBK110 对肿瘤坏死因子吸附性能的研究17 卷 4 期2001 年 7 月生物工程ChineseJoumagofB/otechno/ogyv0ll7NO.4JuIv2001氨基酸修饰大孔吸附树脂 NIK-110 对肿瘤坏死因子吸附性能的研究魏佼俞耀庭孔德领南开大学生物活性材料教育部重点实验室,天津 3O 呻 7摘要应用医用吸附剂直接吸附血浆中的 TNFa 是一种高教的分离方法选用 8 种不同结构和性质的氨基酸修饰大孔吸附树脂 NK-110,通过对_rN 吸附量的测定,吸附动力学曲线和吸附等温线的描述等方法,研究了经修饰后大孔吸附树脂对血装中 TNFa 的吸附性能,结
2、果表明:1 半肮氨酸修饰的 NK_ll0对_rN 的吸附量高,静态吸附120rain 时达 768380ulmL.2.其吸附动力学曲线表明,经半胱氨酸修饰后,相同时间内吸附量更高.且二者吸附量有差别P(001)3 由吸附等温线可见 NK_I】0 对血浆中 TNFa 的吸附量随着溶液浓度的升高而升高,但其吸附率随之呈降低趋势.经半肮氨酸修饰后.其吸附量随着 TNn 浓度的升高而升高.吸附率基本不变.美壁词氨基酸 NK-110,肿瘤坏死因子中围分类号 0647 文献标识码 A吸附文章编号 1000-3061(2001J04414-32-04肿瘤坏死因子 a(TumotNecmsisFae10r)(
3、TN)是由人体内巨噬细胞和活化 T 细胞等产生的一种细胞因子,其作为一种炎症介质,对人体的作用具有双重性:适量的 TN 对机体呈现保护性反应.正常情况下,血浆中有较低水平的 TN 存在,这时维持机体内环境的稳定及组织的更新,改建,都起着重要的调节作用.但另一方面,过量的 TN 对机体产生不利的作用:1.TNFa 是内毒素血症和感染性休克发病机理中主要的致病介质,它的释放早于其他细胞因子,对革兰氏阴性菌诱发的内毒素休克起了重要的内分泌调节作用“.TNFa 可引起心血管功能紊乱,心输出量降低,肝脏损害,甚至引起弥漫性血管凝血,多器官功能衰竭等 2.高浓度 TN 与肿瘤患者的食欲减退,进行型消瘦,氮
4、平衡失调等恶液质综合征的表现密切相关.目前认为,肿瘤坏死因子及其它一系列炎症介质共同介导了内毒素休克时的多器官疾病病生理改变,且 TN 在其发病过程中所起的主导作用.已有一些实验证据表明,具有中和作用的抗TN 单克隆抗体能够预防和治疗因 TN 过量产生而导致的炎症等疾病状态.本文通过选择特定的吸附剂直接吸附血浆中的 TN,使其浓度迅速降低,设法阻断 TNFa 在致病过程中的作用环节.而早期降低 TN 活性亦能减少其它细胞因子的释放,这样既减少了 TN 本身的直接作用;又减弱了由其激活介质所产生的继发性效应,从而达到阻断或减弱致病介质发挥作用的目的.本实验研究了 8 种氨基酸修饰的 NK-110
5、 对血浆中帆的吸附性能,为深人研究适用于全血灌流的高效 TN 亲和吸附剂提供了理论依据.1 实验部分1.1 试剂与仪器NK.110(南开大学分子生物学研究所);甘氨酸,【广组氨酸(第二军医大学政翔化学试剂研究室);L-异亮氨酸(中国科学院上海生物化学研究所);L.半胱氨酸(上海草扬第二中学化工厂);重组人肿瘤坏死因子(北京邦定泰克生物技术公司(1Ou=lng);人新鲜冰冻血浆(天津市血液中心);夹心法 ELISA检测 TNFa 检测盒( 北京邦定泰克生物技术公司);TNZ 一 82 型恒温振荡器(上海跃进医疗器械一厂);酶标仪( .960).1.2 氨基酸修饰 NIK.110 的制备NK.11
6、0 树脂用 95%乙醇充分浸泡后,蒸馏水反复洗涤,去除杂质.尽量吸干水分,加人饱和浓度的8 种氨基酸(Gly,Glu,His,Trp,Phe,Leu,ne,Cys)溶液,室温振荡吸附 20h,以结合不同的氨基酸配体,制得氨基酸系列吸附剂.再用蒸馏水反复洗去残留收稿 13 期:2oo0-12415,修回日期:200104-23.基金项目:中奥台作项目(天津市国际台作基金资助 )和国家自然科学基金项目(30000042)*通讯作者 Tel:86-2223508626;Fax:8622-23501393:.rnaJl:ho 口 gPublielti曲4 期魏使等:氨基酸修饰太孔吸附材脂 NK-110
7、 对肿瘤坏死因子吸附性能的研究氨基酸,然后用生理盐水平衡.1.3 氨基酸修饰量的测定取所制得的氨基酸系列吸附剂各 lmL,烘干水分,加入 0.5%茚三酮.乙醇溶液 5mL,10015min,570nm 可见分光光度计比色.1.4 静态吸附量和吸附率的测定准确量取 1.0mL 生理盐水平衡的氨基酸修饰NK.110 树脂,尽量吸干水分,加入 3000u/mL 浓度的TNFa 血浆 ,于 37恒温振荡至吸附平衡,夹心法ELISA 检测吸附前后的 TNFa 浓度.按下式计算树脂的吸附量和吸附率:Q:E%:100%20式中:吸附量;C.一起始浓度;C 平衡浓度;V 一溶液体积;.树脂体积;%一吸附率1.
8、5 静态吸附动力学量取 1mL 湿树脂,加入 3mL 的 TNFa(300Ou/mL)血浆,于 37恒温振荡,分别于吸附 15,3O,60,120,180,240min 取样,夹心法 ELISA 试剂盒检测体系的TNh 浓度 .1.6 吸附等温线配制 3000utmL,2500u/mL,2000u/mL,1500u/mL,1000u/mL5 种浓度的 TNFa 血浆,在 37进行吸附实验,测定 TNFa 的吸附量.2 结果与讨论2.1 不同氨基酸修饰对 NK.110 吸附性能的影响选用 8 种不同结构和性质的氨基酸修饰 NK.110 树脂,经静态吸附实验,比较吸附量和吸附率的大小(图 1)8
9、种吸附剂均有不同的吸附功效(图1).经单因素方差分析,8 者吸附量有差别(P0O1),其中以半胱氨酸修饰的 NK-110 吸附量最高,达 7683.80u/mL,吸附率为 85.38%.氨基酸的性质.,固定量,对吸附性能的影响见表 1.GlyGinHisPheLealieCysAminoaad图 1 氨基酸修饰 NK-110 对肿瘤坏死因子的吸附作用Fig.1AdsorptionofTNFbyaminoacidmodifiedNK-110裹 1 氨基酸的特性和固定对吸附能力的影响Table1EffectofcharacterandquanlityofIIalllOaddimmobdlzedad
10、sorptionclp 啦经多因素相关分析,表明其吸附量的差异与pKa.NH 呈正相关 ,相关系数 0.825(P0.05),与氨基酸其它特性及固定量无明显相关性(P0.05).从解离公式可知,p(pKa-N)表示 N-c-COO 一和 HNCH2.COOH 的摩尔浓度相等,即R.=Ro.如果利用 Handerson.Hasselbalch 公式:pH=pK+ts,以及 pI(:和 p,即可计算出在pH=7.4 条件下此 8 种氨基酸的各种离子的比例 .此 8 种氨基酸 NCH 一 CO0 一和 HNCH 一 CO0 一的比例分别为 0.004169(Gly),0.008511(Glu),0O
11、11749(His),0.009772(T 叩),0.012303(Phe),0.004571(Leu),0.004365(1le),0.000501(Cys).经相关分析,此比例与吸附量呈负相关,相关系数为一 0.888(P0.O1).由此可知,在体液 pH 值条件下,NCH=.CO0 离子数相对越少,越有利于吸附.2.2 静态吸附动力学经静态吸附筛选,可见 Cys 修饰 NK.110 吸附效果最好,故进一步研究其吸附特性.半胱氨酸修饰NK.110 的静态吸附动力学曲线反映了 TNFa 的吸附【1gj 一言 gSg口生物工程 l7 卷量随时间的变化关系(图 2).图 2 吸附时间对吸附量的影
12、响Fig.2ChangeofRmoltltttadsorbedwithtime从图中可见,经半胱氨酸修饰的 NK.110 与未修饰 NK.110 大孔树脂相比,二者的吸附动力学曲线相似.但经半胱氨酸修饰后,相同时间内吸附量更高,其静态吸附率可在 60rain 之内达到 70.I9%(6317.45mL),在 120rain 时,已达到 85.38%(7683.80ulmLge1),在 240min 时为 92.24%(8301.71ulmL 州). 而未经 cys 修饰的 NK.110 吸附量与吸附率分别为 56.59%(5093.03u/mL),76.53%(6888.02u/mLge1),
13、88.40%(7956.12ulmL).经单因素方差分析,二者吸附量有差别(P001).吸附剂的化学组成及其表面性质对吸附作用的影响很大.即使同一类吸附剂.当其比表面积,孔结构,后处理条件不同时,吸附能力也可能有很大差异.而且还要考虑到吸附剂表面基团与吸附质相互作用的性质 NK.110 为非极性树脂,比表面积450500m2tg,平均孔径 16oA.比较其吸附量和吸附率的差异,可能与半胱氨酸的结构特征及 TNn的性质有关.半胱氨酸是含硫氨基酸,R 基中的巯基 f.SH)呈极性.文献报道,在体内 TNF 发挥生物学效应必须先与靶细胞上的 TNF 受体相结合,二者具有较高的亲和力,其亲和常数约为
14、310 一.然而 TNF 受体的胞外结构区是由 4 个富含半胱氨酸的功能区组成,此功能区的结构为 Cys.x.cys.x.Cys,说明半胱氨酸在 TNF 与其受体的结合中可能发挥着重要作用.这表明,用半胱氨酸修饰NK.110 树脂亦可提高其对血浆中 TNFa 的吸附量.2.3 吸附等温线一系列浓度的 TNFa 血浆,在 37进行静态吸附,以吸附量对溶液平衡浓度作图,得吸附等温线(图 3).图 3 吸附等温线Fig.3Adsotionisotherm由图 3,4 可见,NK.110 对血浆中 TNFa 的吸附量随着溶液浓度的升高而升高,但其吸附率随之呈降低趋势.经半胱氨酸修饰后,其吸附量随着 T
15、NFa浓度的升高而升高,吸附率基本不变.Ccmcentratton/(temL)图 4 浓度对吸附覃的影响Fig.4ChangeofadsqcdonpercentagewithconeetltralJ.Otl对于固.液吸附过程.由于真实液体体系的非理想性,一直缺乏合理的模型描述平衡,对平衡模型的研究主要是沿用气.固吸附过程的一些表达式.在稀溶液吸附平衡的研究中,由于稀溶液相对更接近理想状态,人们应用较多的平衡方程是 Langnmir 方程,该方程是基于均一表面单层吸附这一假设的.其一般形式为:q=或 g=式中:q 为饱和吸附容量,为吸附平衡的解离常数,蜀为结合常数.根据 Giles 等的等温线
16、分类,二者的吸附等温线形态均呈“L,型,表示在溶液中 TNn 比溶剂分子更易被吸附,即溶剂没有强烈的竞争吸附能力.但经半胱氨酸修饰后,其起始部分斜率大于 NK.110,表明溶剂分子对 TNFa 的竞s;名壹苦口目,0【gj0i 蛋喜日营目 g 言苦4 期魏佼等 t 氨基酸修饰大孔吸附树脂 NK-110 对肿瘤坏死因子吸附性能的研究争吸附更小.当平衡浓度增大时,半胱氨酸修饰的NK-110 吸附等温线有一较快的上升阶段,这可能是由于被吸附的_rNn 分子对液相中的_rN 吸引作用,或吸附分子形成更紧密的排列也可能有多层吸附的发生.3 小结本文选用了 8 种不同结构和性质的氨基酸修饰大孔吸附树脂 N
17、K-110 吸附血浆中的 TNFa,通过树脂的筛选,静态吸附动力学衄线和吸附等温线的描述,结果表明经半胱氨酸修饰后 NK-110 树脂对血浆中的 TNFa 具有良好的吸附能力.虽然,经 Cys 修饰后的 NK-110 不易再生,较难重复使用,但本实验所得规律为深人研究 TNFa 亲和吸附剂的配基,提供了依据.且本文采用物理吸附方法进行修饰,操作简便,条件温和,而且载体与配基之间不发生化学反应,配基的结构和活性改变较小,有一定的理论研究意义,为进一步研制新型的,高特异性和高吸附量的TNFa 吸附剂提供了理论依据.REnRENcEs(参考文献1l23xDNicdauDP,NdTIgalecHdof
18、Circ,latlagIsisfactor-alph.prodtlonduringtheprogressionofmtendotcicsep-sisapy,l,47(3】:l942O2JEMTnroalsfactoralpha,iatedeukin1andhuedcyto-kilBinbraindevelolnent:normalandpnbd0.Dev 胁【.1992.14:1 一 l0AguiUonJC,EscoharA.FiraVa1.DailyproducfiofhlmmnroslsrinLipapoyharlde(LPS)-stimulatedbloodcuhure5aY 日 Eur
19、Cyokiae.2901.12(1):1051104HviDJ,ElkalayMA.LinATTRevalofc)okinfroraH.mglufiombyacLptlonohiosilJBic4echrtofogyandBing,needng.1994,44(9):10“2310305jH8iM,HnghRD,KeHMo2 咖一 pedusionthrouadsorbentsandpuhrafilttlontoeendoxinandcytc.kinCircsdatoryShock,1992.36:182188【6JTeuaC,CavailLonJM,CussiGContln.ousplasm
20、afihrafi0ncoapledwithrbentstmermu/ona.g,1998.53:8.186189【7JAkassagloK,PwbertL,KontngecagosGA5Im-specificbutT10t-specificmbraneTNFtriggersinllanmmtionandde-genationinthecentmlssystem0fttansgenicfJDlwf,1997,1:438445L8JAbrahamE,WunderinkR.郸 IveHFcaevandsafetyofl0 口 0c=l0nalantilxMytobtUDTc 瑚 isfactorin
21、patients 们 thBpsdr0m:Arandonfid.onh.Iled,double-blind,mucem 町clinicaltrial.1995,273:934 941L9JB 一姐 CSC,OldenRWV,StoutenbeekCP.Cvtoldnefiltrationandadrptionduringpposldilationhemofiltrationinfmdif-fer 曲 tmemnBloodP咖,1998.16:26126810WuGY(吴冠芸 ),P 卸 Hz(潘华珍),WuH(吴辉).cex.peritaldatam 叽 uinhiochemistryandl
22、ecuhrbiology(生物化学与分子生物学实验常用数据手册),Beljing:ScJePress,1999,pp155156iiSIgNT(沈同),BLNGJY(王镜岩),ZHAOBT(赵邦悌)Bicchesm-唧( 生物化学 ),Beijlng:IgherEdlId 帅 Press,19,pP 踮93l12JBannerDw.DA.1anes.Crysta1 日 m1oftheluhteh 一 55kDF 瑚 huTNc 啪 p1ex:i 叫呻 forF 口I/valionGe,1993,:43144513s 衄 Y(孙彦 ).E 口 need“Eofhidnglealseparatio
23、n(生物分离工程),Beljing:ChemistryindmtryPress,1998,PP13613714GUTR(顾惕),ZHUSY( 朱涉瑶),uWL(李外郎)Intecfaceclle 咖日竹( 表面化学),咐:Sek,ceP 恻,1999,PP309345AdsorptionofTNFaontotheAminoAdd-modifiedNK-110ResinWEIJiaoYUYaoTingKONGDeLing(研 LaboratoryBioaetiveMaterials,MinistryEducat/on,Naaka/Uwkms2,300071,wAbin-actItisaeffec
24、tivewaytoremoveTumotNeerosisFactor(TNFe)fiomplasmabyadsorbent.Inthepresentstudy,NK-Owasmodifiedby8aminoacidstopreparetheadsorbentstobeusedinthestaticadsorptionexperimentsofTNFa.Wehavestadiedtheadsorptioncapacity.kineticprofilesandadsorptionisotermofCysnmdifiedNK.110.andflonlcomparisonweremadebetweenCysmodifiedNK.110andunmodifiedone.eexperimentalresultsshawthattheCysmodifiedNK-110exhihitedsuperiorad-so.ioncapacitywhichis76838Ou/mL,andtheadsorptionpercentagei885.38%at120mininstableadsoion.ComparedwithunmodifiedNK-
