1、植物G蛋白信号转导,主讲人：李鹏,生物体在生长发育过程中不断地与环境进行物质交换，因此，负责识别、转导、感知环境信号的转导途（signaling transduction pathway）成为人们感兴趣的研究对象，尤其是比原核生物更完善、更精细的真核生物的信号转导途径。从已经研究过的动物细胞胞内信号系统来看，胞内信号是通过位于细胞膜上的，与膜结合的中介蛋白质将信息转导到胞内的，这种中介蛋白质是一种鸟苷酸结合蛋白质，称为G蛋白。G蛋白主要有两类：一类是与膜受体偶联的异三聚体G蛋白 (Heterotrimeric GTP binding proteins)；另一类是非膜蛋白，称为小G蛋白（Smal
2、l GTP binding protein）。,G蛋白的种类已多达40余种，大多数存在于细胞膜上，由、三个亚基构成，总分子量为100kDa左右。其中亚单位在多数G蛋白中都非常类似，分子量36kDa左右。亚单位分子量在8-11kDa之间。根据两个亚基的不同可以将G蛋白分为Gs、Gi、Go、Gq、G?及Gt等六类。这些不同类型的G蛋白在信号传递过程各种发挥不同的作用。,（1）Gs：细胞表面受体与Gs（stimulating adenylate cyclase g protein,Gs）偶联激活腺苷酸环化酶，产生cAMP第二信使，继而激活cAMP依赖的蛋白激酶。 （2）Gi：细胞表面受体同Gi（in
3、hibitory adenylate cyclase g protein,Gi）偶联则产生与Gs相反的生物学效应。 （3）Gt：可以激活cGMP磷酸二酯酶，同视觉有关。 （4）Go：可以产生百日咳杆菌毒不导致的一系列效应。 （5）Gq：同PLC偶联，在磷脂酰肌醇代谢途径信号传递过程中发挥重要作用。,1 G蛋白的基本结构和种类,G蛋白(Gprotein/GTP binding protein)是能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有水解GTP生成GDP，即具有GTP酶(GTPase)活性的蛋白。G蛋白是一个超级家族(GTP-binding proteins superfamily)，包括膜受偶联的异源三聚体
4、G蛋白(Heterotrimeric GTP binding protein).异源三聚体G蛋白，分子量大(100kD左右)，是受鸟嘌呤核苷酸调控的超级家族的信号传导分子；而小G蛋白，分子量小(20-30kD)，为单体，可能号传导无直接联系。,一、G蛋白的概念和分类,G蛋白是利用GDP（二磷酸鸟苷）（图中紫色的部分）来控制信息的传递的分子开关。结合着GDP的G蛋白是不活跃的。当GDP的被GTP（三磷酸鸟苷）取代后，G蛋白就可以传递信息了。G蛋白形式多样，大部分传递信息。这里展示的是在术语上称为heterotrimeric G蛋白的分子，因为它们由三条分子链构成：链(茶色)、链（蓝色）和链（绿色
5、）。这从中红色的部分是在链/亚基表面的对信号传递起重要作用的部分。,G蛋白在细胞膜内传递信息。当一个特定的荷尔蒙或神经递质（比如肾上腺素）结合到受体上后，受体被激活。受体的分子形状改变了，它得以结合到G蛋白上。这导致了G蛋白释放GDP并和GTP结合。GTP（图上显示为红色）引发了一系列变形反应，G蛋白因此分裂成两部分。亚基成为自由亚基，和结合在它上面的GTP一起沿着细胞膜移动并最终和腺苷酸环化酶结合，苷酸环化酶被激活。活跃的苷酸环化酶生产出大量可以在细胞内传递信息的环腺苷酸（cAMP）。同时结合在亚基上的GTP将变成GDP，G蛋白将回到不活跃状态。,异三聚体G蛋白,异三聚体G蛋白（简称G蛋白）
6、是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有GTP水解酶活性，广泛存在于真核生物中的一类蛋白。异三聚体G蛋白介导的细胞信号转导是真核生物细胞信号转导机制中最为保守的信号转导机制之一，它将胞外信号转换为胞内信号，并传递给胞内效应蛋白（effectors）进而调节细胞的生长和发育等过程。典型的G蛋白介导的信号转导途径如图1所示。G蛋白由三种不同的亚基组成，即亚基（G）、亚基（G）和亚基(G) 其信号系统是由G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）、G蛋白和效应器三部分组成。当特异性的配体与膜上的GPCR结合后，引起GPCR构象发生改变，进而激活下游的G蛋白，催化G蛋白亚基
7、结合的鸟苷二磷酸（GDP）替换为鸟苷三磷酸（GTP），从而使亚基构象改变，降低亚基和亚基的亲和力，使异三聚体为解离为G（GTP）和G二聚体。解离的G（GTP）和G分别调控下游各自的效应器，产生第二信使，通过一系列信号转导过程最终引发胞内相关基因的表达，诱导细胞的生理生化反应。当G亚基利用自身的GTP水解酶活性催化GTP水解为GDP，使G（GDP）与效应物解离，并重新结合G，形成非活性的异三聚体G蛋白，从而使信号终止。G蛋白在此过程中充当分子开关的角色。因此，G亚基处于GTP结合状态的寿命控制着信号转导途径持续时间的长短。,G蛋白的基本结构：100kD左右，由、三种亚基组成，在天然电泳中与仍紧密
8、结合在一起。亚基分子量在39-46kD之间，差别最大，被用作G蛋白的分类依据。其共同的特点是，具有一个GTP结合位点，本身具有GTP酶的活性，即可以把GTP水解成GDP和无机磷酸；在某些G蛋白的亚基上，有些特殊的氨基酸（Arg或Cys）残基可被特定的细胞毒素所修饰，从而调节其生理功能。在一级结构中有几个高度保守的结构域，即P区域、G区域和G区域。P与G区域都与GTP结合及GTP酶活力有关；G区域则与GTP结合，并与腺苷酸环化酶相互作用有关。另外，与受体接触的是G的C端的螺旋等。,亚基分子量为36kD左右，各种G蛋白的亚基在肽图和免疫化学特性及氨基酸序列方面很相似，亚基分子量在7-8kD之间，各
9、种G蛋白之间亚基也比较相似但个别的也有些区别；它与亚基非共价紧密结合。,小G蛋白,G蛋白在结构上没有跨膜蛋白的特点，它们能够固定于细胞膜内侧，主要是通过对起亚基上氨基酸残基的脂化修饰作用，这些修饰作用把G蛋白锚定在细胞膜上。能够激活腺苷酸环化酶的G蛋白称为Gs,对该酶有抑制作用的称为Gi。当Gs处于非活化态时，为异三聚体，亚基上结合着GDP，此时受体及环化酶亦无活性；激素配体与受体结合后导致受体构象改变，其上与Gs结合位点暴露，受体与Gs在膜上扩散导致两者结合，形成受体-Gs复合体后，Gs亚基构象改变，排斥GDP，结合了GTP而活化，亚基从而与亚基解离，同时暴露出与环化酶结合位点；亚基与环化酶
10、结合而使后者活化，利用ATP生成cAMP；一段时间后，亚基上的GTP酶活性使结合的GTP水解为GDP,亚基恢复最初构象，从而与环化酶分离，环化酶活化终止，亚基从新与亚基复合体结合。重复此过程。,（四） 小G蛋白,小G蛋白（Small G Protein）因分子量只有2030KD而得名，同样具有GTP酶活性，在多种细胞反应中具有开关作用。第一个被发现的小G蛋白是Ras，它是ras基因5的产物。其它的还有Rho，SEC4，YPT1等，微管蛋白亚基也是一种小G蛋白。 小G蛋白的共同特点是，当结合了GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则回复
11、到非活化状态。这一点与G类似，但是小G蛋白的分子量明显低于G。 在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。,YangZ(2002)SmallGTPase:versatilesignalingswitches inplants.Th
12、ePlantCell,14:S375-S388,小G蛋白是单体鸟苷酸结合蛋白，由一条多肽链构成,分子量较小,一般为20 30kDa。根据在细胞中功能不同,小G蛋白可分为5个亚家族, 包括Ras、Rho、Rad、Arf和Ran。Ras家族在酵母和哺 乳动物中调节细胞分化过程, Rho家族调控肌动蛋白重 组过程和参与MAP 激酶的细胞信号转导, Rad 和Arf 家族在膜转运过程中起着不同的重要作用,而Ran家 族在核孔位置调节着蛋白和RNA分子的运输过程。,在细胞内还存在另一类G蛋白，这类G蛋白具有鸟核苷酸的结合位点，有GTP酶活性，其功能也受鸟核苷酸调节，但与跨膜信息传递似科无直接相关。在结构
13、上不同于前述的G蛋白，分子量较小，在20-30kDa之间，不是以、三聚体方式存在，而是单体分子，因此被称为小G蛋白（small G proteins）。如ras表达产物为一种小G蛋白。小G蛋白同ras蛋白具有同源性，同属于ras超家族（ras superfamily）。哺乳动物G蛋白中属ras超家族约有50多个成员，根据它们序列同源性相近程度又可以分为Ras、Rho和Rab三个主要的亚家族。,小的功能,小G蛋白：近年来研究发现小G蛋白，特别是一些原癌基因表达产物有着广泛的调节功能。Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通
14、（membrane traffic）。此外，Rho和Rab亚家庭可能分别参与淋巴细胞极化（polarization）和抗原的提呈。某些信号蛋白通过SH-3功能区将酪氨酸激酶途径同一些由小G蛋白所控制的途径连接起来，如Rho（与Ras有30%同源性）调节胞浆中微丝上肌动蛋白的聚合或解离，从而影响细胞形态。这一事实解释了某些含有SH-3的蛋白同细胞骨架某些成份相关联或调节它们的功能,巨大G蛋白,植物中还有另外一类G蛋白，称为“超大G蛋白”( extra large G p rotein，XLGs) 12 Lee Y R，et. Plant Mol Biol， 1999， 13 Assman A M
15、. Heterotrimeric and unconventional GTP binding proteins in plant cell signaling. Plant Cell, 2002。在拟南芥中鉴定到3个、在水稻中鉴定出4个XLG基因。这些XLG基因编码的蛋白是通常多细胞生物G蛋白的两倍大，其C端与植物G蛋白GPA1的同源性约50% ，其N端富含色氨酸，且含有核定位位点。生化分析表明,拟南芥XLG1是一种GTP 结合蛋白。然而目前尚未有关于XLG能和常规G发生相互作用的证据，因此，对植物XLGs的功能研究有待深入。,二、调节异三元G蛋白信号途径的因子,1、G蛋白偶联受体（GPCR
16、） 2、G蛋白信号转导调节子（RGS） 3、鸟苷酸解离抑制因子（GDI ） 4、蛋白下游的效应分子,G蛋白偶联受体（GPCR）,与G蛋白偶联的多种受体具有共同的结构功能特点：分子量40-50kDa左右，由350-500氨基酸组组成，形成7个由疏水氨基酸组成的螺旋区段，反复7次穿越细胞膜的脂质双层。肽链的N末端在胞膜外，C末端在细胞内。N末端上常有许多糖基修饰。从功能上看，受体的识别区域并不象一般想象的那样在胞膜的外部，实际上是由7个跨膜区段间通过特定氨基酸残基之间的相互作用形成复杂的空间构象。配体结合于识别区域之后，即导致整个受体构象的变化。受体肽链的C末端和连接第5和第6个跨膜区段的第三个胞
17、内环是G蛋白结合部位。 由G蛋白耦联受体所介导的细胞信号通路主要包括：cAMP信号通路和磷脂酰肌醇信号通路。,图：G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白,G蛋白偶联受体（GPCR）,G蛋白偶联受体的信号转导途径由四部分组成： a 细胞膜受体 b G蛋白 c 第二信使 d 效应物,第二信使,细胞内信使一般具有以下三个特点： (1)多为小分子，且不位于能量代谢途径的中心； (2)在细胞中的浓度或分布可以迅速地改变； (3)作为变构效应剂可作用于相应的靶分子，已知的靶分子主要为各种蛋白激酶。,cAMP（环磷酸腺苷）,（1）cAMP（环磷酸腺苷） 生成：腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP; 代谢：cAMP磷酸
18、二酯酶水解cAMP产生5-AMP 功能： a 激活蛋白激酶A b 抑制蛋白磷酸酯酶 cAMP产生后，主要通过蛋白脂磷酸化作用继续传递信息，这是由细胞内一种专一酶-依赖cAMP的蛋白激酶（PKA），将代谢途径中的一些靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，将其激活或钝化。这些被共价修饰的靶蛋白往往是一些关键调节酶或重要功能蛋白，因而可以介导胞外信号，调节细胞反应。当cAMP信号终止后，靶蛋白的活性则在蛋白质脱磷酸化作用下恢复原状。,（2）cGMP(环磷酸鸟苷),（2）cGMP(环磷酸鸟苷) 生成酶：鸟苷酸环化酶 代谢酶：cGMP磷酸二酯酶 功能： a 激活蛋白激酶G b 调控细胞膜离子通道,三磷酸肌
19、醇（IP3）和甘油二酯（DAG）,（3）三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG） G-蛋白偶联受体激活磷脂酶C，生成IP3及DAG 功能： a IP3：开放胞内钙库，激活Ca2+途径。 b DAD：在Ca2+和磷脂酰丝氨酸存在下，激活蛋白激酶C。 以肌醇磷脂代谢为基础的细胞信号系统，最大的特点是胞外信号被膜受体接受后，同时产生两个胞内信使，分别激动两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC途径。IP3通过作用于内质网膜上特异的受体使其内部Ca2+释放，引起胞内Ca2+水平的增加，从而启动胞内Ca2+信号系统，即通过
20、依赖Ca2+、钙结合蛋白的酶类活性变化来调节和控制一系列的生理过程。DG通过激活PKC，以磷酸化的形式对许多蛋白质和酶类进行修饰，从而调节和控制另外一系列的生理过程。两条途径相辅相成，又互相约束。同时两条通路信号的强弱又可根据原始信号的不同特征在细胞内加以调节，而使细胞对这些外界信号作出不同的反应。,与G蛋白偶联后产生胞内信使如cAMP,cGMP,DG,IP3,等，将信号传导至胞内,G蛋白介导的细胞信号转导模式,RGS与G蛋白信号转导的调节,Dohlman(1996)等最初发现,啤酒酵母RGS蛋白是G蛋白信号转导的负调节子。随着哺 乳动物RGS蛋白与Gi3相互作用的证实,RGS迅速引起了人们的
21、重视。到目前为止,已经发 现20种哺乳动物基因编码具有RGS核心区域的蛋白。通常情况下,这种120氨基酸的核心 两端具有高度可变的臂,三者共同构成一个25kD的蛋白质分子3。 RGS4和Gi1-GDPALF-4晶体结构中3,只有RGS的核心区域是可见的,已经证实该区 域含有RGS4作用的所有元件4,RGS4核心区包含一个典型的右手性反平行4-螺旋束,它与 Gi1的“开关”区、相互作用。G蛋白的“开关”和区域残基与GTP的结合和水解 密切相关,RGS4不提供与GDP或ALF-4直接作用的任何残基。但RGS4的保守天冬酰胺 (Asn128)残基可以在基础状态与水解的水分子或Gi1的谷氨酰胺(Gln
22、204)残基侧链相互作用, 该残基确定方向并使过渡状态中催化反应的水极化,提示RGS4通过稳定过渡状态G蛋白结 构中的“开关”区起GAP作用,降低激活的能量障碍;Asn128可能通过与水或Gln204相互作用进 一步促进水解。 Coleman5等发现,在Gi1GppNHp的活性部位,一个水分子分别与Glu43侧链和磷酸 基的氧原子形成氢键。催化残基Gln204侧链的结构与GTP-和GDPALF-4复合物中的结构明 显不同。氢结合和空间作用决定了Gln204的位置,它与亲核的水分子相互作用,呈现一种“自 我抑制”状态,RGS可能部分是通过在Gln204占据的位置插入氨基酸侧链释放Gln204,破
23、坏G 的“自我抑制”状态而启动其GTPase活性。,RGS蛋白的作用方式,三、酵母中异三元G蛋白的信号转到途径,1、交配信息素的信号转导途径 2、糖信号转导途径,交配信息素的信号转导途径,酵母配对反应由G蛋白和MAPK级联放大反应介导。传统观点认为，当交配信息素与受体结合时，相关G蛋白被激活引起G与G亚基解离，G对信号转导起正性调节作用，导致基因活化，细胞周期G1期阻滞和产生配对突起，最后细胞融合产生双倍体细胞。然而酵母中交配信息素应答G蛋白的亚单位，即Gpa1，结合GDP与受体偶联形成Gpal-受体复合物，抑制配对反应。遗传学也证据表明，Gpal-GTP通过拮抗Fus3的功能和激活一种未知蛋
24、白与G作用而下调配对反应。（Leberer E，et al， Pheromone signaling an polarized morphogenesis in yeast J. Curr Opin Genet Dev1997,7(1): 59-66.）,四、植物G蛋白的生理功能,1、G蛋白与植物对光的反应 2、G蛋白与植物对激素的反应 3、G蛋白与植物气孔运动 4、G蛋白与植物的抗逆性 5、G蛋白与植物糖信号转导,511 参与光刺激的信号转导,511 参与光刺激的信号转导 早在1987 年,Hasunuma 等人的研究发现红光或远红光能抑制植物GTP 结合活性,推测G蛋白参与了光信号转导.
25、1991 年Romero 等人研究发现CTX可以促进Cab 基因表达,抑制Phy 基因表达,Cab 和Phy 都是受光敏色素调控的基因,后来他们 用光自养的大豆悬浮细胞为材料,用PTX和CTX暗中诱导了Cab 的表达,而PTX 和CTX 都不能诱导不受光敏色素调节的 基因Hsp75 的表达. CTX和PTX这些细菌毒素是G蛋白专一性结合的GTP 活化剂和抑制剂;Neuhaus 等用显微注射技术,以 番茄为材料证实了CTX、GTPs这些G蛋白活化剂对Cab 的表达起诱导作用,而PTX、GDPs这些G蛋白抑制剂对Cab 的表达 起抑制作用. 以上实验证实G蛋白参与了光敏色素调控的某些过程,在植物红
26、光信号转导中起一定作用. 但红光活化G蛋白 的作用方式还不清楚. 1991 年,Warpeha 等人的研究又证明G蛋白可能也参与蓝光的信号转导. 他们用蓝光照射黄花豌豆,可使豌豆顶芽质膜 GTPase 活性增加10 倍之多,使GTPs活性增加5 倍之多.,参与调控K+ 通道,Garley - Grenot 和Assmann 用完整的豌豆保卫细胞原生体为材料证明GTPs、CTX、PTX均抑制了K+ 内流,而GDPs促进了K+ 内流. 武维华的实验也证实了这一点.在以上实验中PTX和CTX的作用多次表现一致,其机理还不清楚,推测可能与其在动物细胞中的作用方式不同有关. （周晓阳等）用群众杨叶片下表
27、皮经过不同浓度的G蛋白激活剂霍乱毒素(CTX)处理后,在扫描电镜下观察了气孔开度的 变化,并用透射电镜结合X-射线能谱显微分析技术,对保卫细胞内的K+、Cl-含量进行了研究。结果表明:CTX能 促进气孔关闭,作用强度随CTX浓度的增加而增强。伴随着气孔关闭,保卫细胞液泡和细胞质中的K+、Cl-含量 都明显下降,而细胞壁中的K+、Cl-含量增加。这提示G蛋白可能通过对保卫细胞内K+、Cl-的调节作用而参与 了气孔运动过程。 由于保卫细胞内的K+、Cl-浓度是调控植物气孔运动的重要因素之一,因此G蛋白对液泡和细胞质中的K+、Cl-移动的调节,对K+、Cl-在细胞不同间隔(compartment)的
28、移动与分配的调节作用,说明G蛋白参与了气孔运动的细胞信号转导过程,G蛋白对K+、Cl-的跨膜运输的调节很可能是其调控气孔运动的生理机制之一。,513 参与植物激素信号转导,有关G蛋白在植物激素信号转导中的作用知之甚少,一些实验只是证明G蛋白参与了植物激素信号转导,但没有一个明 确的结论,如1990 年Zaina 发现IAA 能促进水稻胚芽鞘膜泡组分对GTPS的结合活性和GTPase 活性;Bossen 也报道了GDPS 可抑制GA 诱导的黄花小麦原生体膨大,Jonse 于1998 年也证实了G蛋白活化剂可促进大麦糊粉层淀粉酶基因的表达. Hooley 等也认为异三聚体G蛋白与赤霉素和生长素的转
29、导有关 12 Hooley R ,et al. plant hormone perception and action :a role for Gprotein signal transduction Molecular basis of signal transduc2 tion in plants proceedings of a discussion meeting held 1819February 1998 ,London ,U K. Philosophical transactions of the royal society of London Series BJ .Biolog
30、ical Science ,1998 ,353(1374) :1426 - 1438. .,514 参与病原信号转导 这方面的实验不太多,能提供直接证据的是1995 年Beffa 等人的实验 13 Beffa R ,et al. Cholera toxin elevatespathogen resistance and induces pathogenesis - related gene expression in tobaccoJ . EM2 BO J ,1995 ,14 :5754 - 5760. . Beffa 等利用受光调节的Cab 基因启动子与 CTX结构基因构成嵌合基因导入烟草中
31、,发现转基因烟草对病原的抗性增强,并引发一些病原相关基因的表达和内源水扬酸 的积累,从而证明了G蛋白参与病原信号的转导. Vera - Estrella 等研究发现在活化番茄对真菌病原物防御反应机制的信号转 导中,GTP 结合蛋白具有调节作用.,参与调节根瘤菌中结瘤因子的信号转导 Pringret 等研究结果 14 14 Pingret J L ,Journet E P ,Barker D G. Rhizobiu m Nod factor signaling : Evidence for a G protein - mediated transduction mechanismJ . Plan
32、t Cell ,1998 ,10(5) :659 - 678.表明根瘤因子信号转导机制包括G蛋白调节偶联磷酸肌醇、Ca2+ 、以及第二信使活化的信号途径。 参与花粉萌发和花粉管伸长及细胞外钙调素跨膜信号转导 马力耕等人用免疫印迹、细菌毒素诱导、GTPase 活性测定等方法证实了植物花粉中有异三聚体G蛋白,并进一步证实G蛋白参与了花粉萌发和花粉管伸长. 他们用GTPase 活性法也证明了异三聚体G蛋白偶联细胞外钙调素跨膜信号的转导 10 10 孙大业,等. 细胞信号转导M . 北京:科学出版社,2001. 190 - 198,G蛋白与植物对光的反应,G-蛋白在光敏色素传递早期起作用，其下游的信号
33、链分支，分别对Ca/CaM和cGMP调节从而进一步活化其它调节因子，并在转导过程中相互作用，协同调节编码PS、PS、Cab、ATPase和花色素苷合成相关基因的表达及叶绿体的发育。Bowle提出了光敏色素信号传导模型。,光敏色素信号的传导模型,G蛋白与植物对激素的反应,G-蛋白抑制剂可以消除赤霉素引起的小麦黄化苗原生质体的吸胀效应，IAA可以促进水稻胚芽鞘细胞中G-蛋白的活化。这说明G-蛋白参与植物激素信号的转导过程。Thiel等人报道与植物激素结合蛋白C-端同源的多肽对钾离子通道的调节作用与IAA的作用相似，而此多肽可促进GTPS与玉米微粒体膜的结合。这进一步证明在激素对植物作用过程中，G-蛋白起传递信息的重要作用。,五、有关G蛋白突变体的形态表型,六、植物G蛋白的研究展望,新的GPCR、G蛋白及其效应器基因的克隆； 这些基因在植物细胞信号转导和分化发育中的作用。,G蛋白激活剂霍乱毒素(CTX),
