1、HLAB 无效等位基因 B*5408N 的 核苷酸序列分析(1)作者：吕沁风，朱发明，章伟，何俊俊，王炜，韩浙东，严力行【摘要】本研究探讨 HLA 新的等位基因 HLAB*5408N的分子基础。采用商用抽提试剂盒抽提样本 DNA，利用单链特异性引物 PCR 方法扩增先证者 HLAB 基因的第 2-4 外显子，对 PCR 扩增产物直接进行第 2、3、4 外显子双向测序分析。结果表明：先证者样本测序得到两个等位基因，其中一个等位基因为 HLAB*1527 ，另一个经 blast 验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ295998,DQ295999,DQ296000） 。与
2、最接近的HLAB*5401 等位基因序列相比，新的等位基因仅在第 3 外显子上有 1 个核苷酸不同，即第 553 位 GT，这导致第161 位氨基酸 Glu终止密码，蛋白质的翻译提前终止。血清学方法未能检出 HLAB54 抗原。结论：该等位基因为HLAB 无效表达等位基因，已被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名为 HLAB*5408N 。【关键词】等位基因IdentificationandSequenceAnalysisofANullHLABAlleleHLAB*5408NNewlyDetectedAbstractThestudywaspurposedtoinvestigatethe
3、moleculargeneticbasisforHLAnovelalleleHLAB*5408NinChinesepopulation.DNAwasextractedfromwholebloodbycommercialDNAextractionkit,theHLABexons2-4oftheprobandwasamplifiedbyallelespecificprimersPCRandtheamplifiedproductwassequencedforexons2,3and4bidirectionally.ThesequencingresultsshowedHLABallelesofthepr
4、obandasB*1527andthenovelallele.ThesequencesofthenovelallelehavebeensubmittedtoGenbank（DQ295998,DQ295999,DQ296000）.Afterblastanalysis,thenovelalleleshowedasinglenucleotidemismatchwithHLAB*5401inexon3atposition553GT,whichresultedinanaminoacidchangingfromGlutoprematurestopcodonatposition161.NotheHLAB54
5、antigenspecificityexpressionintheprobandcellswasfoundusingHLAABserologicalTypingTrays.ItisconcludedthatthisalleleisanovelnullalleleandhasbeenofficiallynamedB*5408NbytheWHONomenclatureCommittee.KeywordsHLAB ；allele;sequencing我们在造血干细胞捐献者样本中发现 1 例新的无效等位基因，被世界卫生组织（WHO）HLA 命名委员会正式命名为 HLAB*5408N 。HLA 系统具有
6、高度遗传多态性，存在少量不表达抗原的等位基因（无效等位基因） ，它们在个体中存在有相应的基因序列，但其细胞上缺乏相应的抗原表达，这类等位基因的生物学作用仍需进一步研究1-3 。现将HLAB*5408N 核苷酸序列分析结果报告如下。材料和方法样本来源先证者为女性，浙江籍汉族，为造血干细胞捐献者，在本实验室 HLA 常规分型中因 HLAB 位点出现罕见的反应格局而进一步确认。样本 DNA 提取采用 PELFREEZDNA 抽提试剂盒（DynalBiotech,Wisconsin,USA） ，严格按试剂说明书进行操作。HLA 分型HLAA 、B 、DRB1 基因分型采用 PCRSSO 方法（tepn
7、ellifecodes,stamford,CT） ，严格按试剂说明书进行操作，结果采用自动软件判读。HLAA 、B 血清学分型采用美国 GTI 试剂盒进行操作。中国实验血液学杂志JExpHematolXX;15HLA-B 无效等位基因 B*5408N 的核苷酸序列分析HLAA 基因 2-4 外显子测序分析PCR 扩增引物参照 Dormoy 等4的报道，由上海申能博彩公司合成（表 1） 。扩增反应体系总体积为 100l，其中含 10PCR 缓冲液 10l，样本 DNA200-400ng，TaqDNA聚合酶 U；dNTP、MgCl2 终浓度分别为 mmol/L、mmol/L，引物终浓度为 mol/
8、L。用 ABI 公司的 9700 型 PCR 自动扩增仪扩增，扩增条件为 96预变性 1 分钟，9625 秒，6445 秒，722 分钟，共 22 个循环；9625 秒，6245 秒，722 分钟，共 13 个循环，72延伸 10 分钟后冷却至 4。序列分析 PCR 扩增产物在 2琼脂糖凝胶上电泳 25 分钟，紫外透射仪下显示扩增成功后，从凝胶上切取目的 DNA片段，用 QIAquickGelExtractionKit 试剂盒纯化回收DNA 片段。将回收纯化的扩增片段按 BigDyeSequencingKit试剂盒操作进行测序反应，测序引物见表 1。采用乙醇/醋酸钠法纯化测序 PCR 产物。纯
9、化产物经热变性速冷上ABIPRISM377 测序仪进行 PAGE 电泳，SequenceAnalysis 和MTNavigator 软件进行数据分析。结果PCRSSO 基因分型先证者 HLAA 和 HLADRB1 可清楚指定为HLAA*24XX,;DRB1*04XX,14XX 。HLAB 分型中探针出现罕见反应格局，在假设 445 探针为阴性时,可指定为HLAB*1527,*54XX ，但重复实验 445 探针仍呈阳性。先证者 HLAA 基因 24 外显子序列分析采用 HLAB*15 和 HLAB*54 特异性等位基因引物分别进行 PCR 扩增，PCR 产物直接测序分析后发现，其中一个等位基因
10、为 B*1527，另一个经 blast 验证其为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（DQ295998,DQ295999,DQ296000） 。与最接近的B*5401 等位基因序列相比，新的等位基因仅在第 3 外显子上有 1 个核苷酸不同，即第 553 位 GT（表 2，附图） ，结果导致第 161 位氨基酸 Glu终止密码。该等位基因为新的HLAB 等位基因，被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名为 HLAB*5408N 。血清学分型结果先证者样本血清板反应格局为2A,2B,8D,8E,8F,12C,12A 孔阳性，参照判断表格其血清学特异性可清楚指定为HLAA24 ，
11、 ；HLAB62, 。HLAB54 多克隆抗体反应孔位置为 9F,10F,这两孔反应均为阴性。讨论HLA 复合物位于第 6 号染色体短臂区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA 复合体包括多个基因座位，每一个座位上有多个等位基因，目前仍不断发现新的等位基因3，5-7 。HLA 基因可分为 3 类：HLA 、类基因，每一类基因均含有多个座位。HLA 系统存在异常表达的等位基因，人群中存在的频率为%-%1-3，8 ，它们的命名常在数字名称后加上后缀来表示，现共有 6 种不同的后缀N、L、S、C、A、Q，其中“N”表示不表达或称为无效表达（null） ；
12、“L”表示低表达量的等位基因；“S”表示等位基因编码的蛋白以可溶性分泌方式表达，但细胞表面不表达；“C”表示等位基因编码产物存在细胞浆中，但细胞表面不表达；“A”表示异常表达，其编码蛋白质是否表达有疑义；“Q”表示等位基因突变点位于已被证实能影响蛋白正常表达的区域。现发现的 HLA 异常表达等位基因为 80 个，其中 HLAA 为 36 个，HLAB 为 25 个，HLAC 为 6 个，HLADRB 为 7 个，其它 HLA 位点为 6 个。其形成的分子机制主要为碱基插入、缺失、启动子区域突变、外显子点突变、内含子拼接位点突变等4 。已经证实 HLA 类基因的第 2、3、4 外显子分别编码 链的 1、2、3 结构域，其中 1、2 两个结构域位于 HLA 类分子的顶部，共同组成抗原肽结合区，是分子的可变区和抗原性多肽识别的部位。本例 HLAB*5408N 无效等位基因的外显子 3 发生点突变，提前形成终止密码，在氨基酸第 161 位处合成链被终止，因此突变后 2 结构域中氨基酸链长度为 71 个，只有野生型的%，其抗原肽结合区发生明显的改变，这可能是其抗原特异性不表达的原因。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
