1、ELISA 检测 p24 抗原用于诊断 HIV 感染的研究现状(1)关键词ELISA；p24；HIV 1HIV 感染实验诊断的研究概况HIV 主要通过性接触、血液和母婴传播。近年来，欠发达国家的感染人数超过发达国家。预计到 XX 年我国感染 HIV 的人数将超过 1000 万。目前测定血清 HIV 抗体是诊断 HIV 感染的常规实验方法，但是测定 HIV 抗体有局限性：有超过 70%的 HIV 感染者在感染 6 个月后才能检测出抗体，在同性恋群体，这个数字超过 80%，检测技术增加了HIV“窗口期”传播的危险1 ；新生儿产生抗体需要出生1 年后，来自母亲的 HIV 抗体会致使假阳性产生；HIV
2、 抗体持续存在，艾滋病晚期时消失，无法作为治疗监测的稳定指标。2p24 的来源和实验价值24kDa 的蛋白质 p24 是 HIV 病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24 蛋白的氨基酸序列在 HIV 各毒株之间高度保守，缺失 p24 会导致病毒无法正常组装。衣壳蛋白 p24 特异性很强，与多数其他逆转录病毒无交叉反应，可以用于 HIV 感染的早期诊断，抗 HIV 药物疗效的检测及 HIV 感染者发展为艾滋病的动态观察。HIV1 感染机体后,感染者血液中最早出现的是病毒gag 基因表达产物 p24 抗原,然后才出现相应的特异性抗HIV 抗体,以后随抗体滴度的升高 p24
3、 抗原含量呈逐渐下降的趋势,以至检测不出。在病情发展后期,病毒大量复制,机体免疫力下降,所产生的抗体不足以中和病毒抗原时,p24 抗原在血中又可测出。HIV 阳性母亲所生育的婴儿 30%可能已受到感染,但由于婴儿体内母源性抗 HIV 抗体可持续 13 个月21 个月之久,常规检测抗 HIV 抗体不适用于婴儿,而p24 抗原的检测则可弥补这一不足。3p24 抗原用于 HIV 感染的诊断HIV1 和 HIV2 的 p24 抗原不同，但有轻微的交叉反应。因 HIV2 主要局限于西部非洲，目前 p24 抗原的研究主要针对 HIV1 感染。SchpbachJ 比较 245 份HIV1 感染成人不同阶段的
4、血样，发现血浆中 p24 抗原浓度高于血清2 ，因此建议检测血浆中 p24 抗原。p24 抗原测定主要存在的问题：机体产生针对 p24 的抗体，抗原抗体结合形成免疫复合物。感染初期，随着抗体大量产生，免疫复合物形成，游离 p24 抗原减少，致使 ELISA 测定 p24抗原得出假阴性结果。为提高 p24 检测 HIV 感染的敏感度，在检测之前需要将抗原抗体复合物分开。将抗原从免疫复合物上分开主要通过加热和酸碱中和。酶标记抗原斑点试验（EnzymeLabelledAntigenSpotTest,ELAST）能显著提高ELISA 实验的敏感度和特异度。实验步骤患者血浆用%三硝基甲苯稀释至 16 比
5、例后 100加热 5min。已知浓度0pg/ml、pg/ml、1pg/ml、pg/ml、5pg/ml、20pg/ml、40pg/ml、80pg/ml 的 p24 抗原作为对照同时操作。所有标本（100l/份）加入微孔中 37孵育 60min 后，用稀释的磷酸盐缓冲液（PBS）洗板后，加入 100l 用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗 p24 抗体，再 37孵育 60min。洗板后，来自 ELASTELISA 系统的 100l 生物素酪胺加入微孔中，室温下孵育 60min。再次洗板后，来自 ELASTELISA 系统的链霉素辣根过氧化物酶用 1%小牛血清PBS 吐温 20ml 溶液稀释至 150
6、0，取 100l 加入每个孔中，室温下孵育30min 后洗板。100l 四甲基联苯胺底物加入微孔中，室温下孵育 30min。然后加入 100l1mol/L 的硫酸终止显色反应。15min 内 450nm 测定吸光度，当吸光度时被认为是阳性3 。敏感度和特异度 SutthentR 等发现采取ELASTELISA 方法测定血浆 p24 的线性范围是pg/ml80pg/ml。针对新生儿感染 HIV 的检测，p24 检测的敏感度与 HIV1RNA 检测的敏感度相同，高于检测HIV1DNA （%） ，三种方法的特异度都可达 100%3 。SchupbachJ 等研究 390 例 HIV 感染母亲生产的婴
7、儿，发现经过中和抗体，p24 检测的特异度可达 100%，在 125 例感染 HIV 的儿童中，p24 检测敏感度可达 97%高于 PCR 检测HIVDNA（96%）和病毒培养结果（77%） 。普通采用免疫复合物分离技术测定 p24 抗原的方法敏感度低，而且只能检出50%没有症状的 HIV 患者。如今已有商品化试剂盒（bioMerieux）采用 ELASTELISA 方法检测 p24 抗原，其敏感度和特异度能和 PCR 检测 HIV1RNA 相媲美。4 检测 p24 抗原的方法临床价值评判p24 抗原用于 HIV1 的早期诊断成人 HIV 感染至抗体阳转需要 6 个月时间1 。p24 抗原在感
8、染早期，病毒大量复制而抗体产生很少时就能被检测出来4 。通过检测血浆 p24 抗原，可以将“窗口期”减短至 20d，此时抗体尚为阴性5，6 。因此对献血员进行 p24 抗原筛查很有必要性。美国 FDA 已规定,自 1995 年 8 月起,所有全血、成分血、白细胞和原料血浆的献血员,在献血前必须进行HIV1 抗原的筛选。HIV 感染母亲是所生育的新生儿中 30%会感染 HIV。检测脐带血和新生儿血浆中的 p24 抗原可判断新生儿感染 HIV 是先天性还是在产道中感染所致。感染 HIV新生儿早期使用齐多夫定（zidovudin）可降低 HIV 母婴传播的危险率7 。p24 抗原用于 HIV 治疗的
9、监测目前主要是把血液中HIV1RNA 的数量作为何时开始治疗以及治疗是否有效的标志。因 p24 抗原感染后 20d 即可从血浆中检测出来，并且伴随抗病毒治疗，血液循环中的 p24 抗原的量会减少。采用 ELASTELISA 测定 p24 抗原的方法，最低可检测到 pg/ml的浓度，相当于每毫升有 100 个病毒，而 HIV1RNA 检测正常低限是小于 400 拷贝/ml。故 ELASTELISA 测 p24 抗原的阈值小于测定 HIV1RNA ，并且两种方法的敏感度和特异度都相同。相比之下，p24 抗原更适合作为治疗何时开始以及治疗是否有效的标志物。美国艾滋病临床实验组认为，血浆 p24 浓度
10、下降一半表明抗病毒治疗有效，p24 浓度持续升高表明缺乏有效治疗2 。5 前景与问题目前临床可以用于检测 HIV 感染，并监测疾病进展的方法有：HIV 抗体检测、p24 抗原检测、HIV 核酸检测以及 T 淋巴细胞计数。总的来说 ELISA 检测抗体和 p24 抗原的方法是比较经济，省时，同时也比较节省人力资源的。由于献血者需要同时作 HIV 抗体和 p24 抗原检测，比较费时，国外已有第四代 HIV1 抗体/HIV2 抗体/p24 抗原联合检测 HIV 的商品试剂盒。两项检测同时进行，大大减少了时间，尤其适用于大标本量的筛查。HIV 病毒致病机制主要是蛋白的作用，而非 RNA，所以检测 p2
11、4 抗原能比检测HIVRNA 直观地预测爱滋病进展。ELASTELISA 测定血浆 p24抗原作为一种操作简单、经济、省时高效的实验方法，具有良好的敏感度和特异度，检测阈值较 HIV1RNA 检测还低。可以作为抗体阴性的疑似 HIV 感染者的检测，献血者的筛查，HIV 感染母亲生产婴儿的检测以及决定何时开始治疗和抗病毒治疗是否有效的监测指标。主要存在的问题：现在对于 p24 抗原的研究集中于 B 亚型，Bonard 等研究发现在非洲 HIV1CRF02_AG 株感染患者中，当 RNA 水平低于5log10copies/ml 时，p24 抗原和 HIV1RNA 的相关性很低（r=） 。Burgisser 等研究发现在大多数非 B 亚型感染中，p24 抗原和 HIV1RNA 的相关性为8,在进行干扰治疗时，p24 抗原水平和 HIV1RNA 水平变化并不平行9 。所以还需要得 p24 抗原到对于诊断 HIV1 非 B 亚型感染的实验证据。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
