1、VEGF 及 CD147 在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究(1)这篇VEGF 及 CD147 在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究论文是程序自动抓取于互联网上，查看更多请点击：论文频道：lwxz/ 作者：岳红红朱平吴振彪樊春梅赵清波鲍炜【摘要】 目的：研究 CD147,VEGF 在单核细胞来源的泡沫细胞中的表达动力学的,探讨 CD147，VEGF 与动脉粥样硬化的关系.方法:以氧化型低密度脂蛋白诱导，建立人单核细胞系（U937 细胞）分化的泡沫细胞模型,通过油红 O 特殊染色的形态学鉴定.将 U937 细胞在不同浓度氧化型低密度脂蛋白（oxLDL,0 ，25，50，100，20
2、0mg/L）条件下培养 48h；在 100mg/LoxLDL 条件下，在培养的不同时间点（0，6，12，24，48h）分别收集泡沫细胞和培养上清，采用流式细胞术检测细胞膜表面 CD147，ELISA 检测培养上清中 VEGF 的表达和 RTPCR 检测 mRNA 表达水平.结果:CD147及 VEGF 表达出现最高峰时的 oxLDL 浓度分别为 25mg/L和 50mg/L；与 100mg/L 的氧化型低密度脂蛋白作用 6,48h后，CD147，VEGF 表达分别出现最高峰；VEGFmRNA 水平出现最高峰时，oxLDL 作用浓度及时间分别为200mg/L，48h.CD147mRNA 水平出现
3、最高峰时 oxLDL 作用浓度及时间分别为 25mg/L，6h，此后，mRNA 水平不变.结论:VEGF 及 CD147 在单核细胞来源的泡沫细胞表达均升高;CD147 表达上调早于 VEGF，低浓度 oxLDL 促进 CD147 表达，高浓度促进 VEGF 的表达;U937 泡沫细胞中 VEGF 的mRNA 水平与 oxLDL 的作用浓度及时间成正相关，泡沫细胞中 CD147 的 mRNA 与 oxLDL 的作用浓度及时间无关. 【关键词】 CD147；血管内皮生长因子类；泡沫细胞；动脉硬化0 引言泡沫细胞（foamcells）是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，其主要来源有两个，一是
4、血液单核细胞，二是血管中膜平滑肌细胞.一般认为在动脉粥样硬化形成的早期，血液中单核细胞进入内皮下间隙，在内膜下被氧化型低密度脂蛋白、炎性介质等激活后分化为巨噬细胞，后者通过其表面的清道夫受体吞噬 oxLDL 形成泡沫细胞，并逐渐演变成脂纹及粥样斑块1.动脉粥样硬化不仅是脂代谢紊乱的过程，也是炎症反应的过程.因此，泡沫细胞是粥样斑块中重要的炎症细胞2.长期的慢性炎症性疾病可导致机体内免疫分子、炎症因子等炎性介质水平明显升高3.不但可调节机体免疫反应，而且能够作用于外周组织导致一系列致动脉粥样硬化代谢功能改变4.研究表明,在泡沫细胞形成过程中 CD147 分子及 VEGF 的表达上调.此外，新近在
5、动脉粥样硬化斑块中也检测到 CD147 分子及血管内皮生长因子（VEGF）等炎症介质,提示其可能参与了动脉粥样硬化的发生5-6.鉴于 CD147 分子及 VEGF在炎性斑块中的作用，且目前鲜有对其在泡沫细胞形成过程中表达变化的研究，我们建立人类单核细胞（U937）源性泡沫细胞模型7 ，进一步探讨 CD147，VEGF 等炎性介质在动脉粥样硬化发生中的作用.1 材料和方法材料低密度脂蛋白（LDL）及 VEGF 的 ELISA 检测试剂盒（CHENICON，US） ；硫代巴比妥酸（TBA） （南京建成生物工程研究所） ；FITC 标记小鼠抗人 CD147（RD，US）.FACSCalibur 流式
6、细胞仪.方法LDL 的制备将 LDL 置于含 10mol/LCuSO4 的磷酸缓冲液（PBS）中,37透析 12h 后,在 1g/LEDTA 的 PBS 中透析24h,m 微孔滤膜过滤除菌备用.用硫代巴比妥酸物质的含量鉴定 oxLDL, 氧化后每毫克胆固醇中丙二醛含量为mol/g.细胞株及泡沫细胞模型的建立 U937 细胞株系人类单核细胞系,由中国科学院上海细胞生物研究所提供，在含100ml/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养基中悬浮生长,置于50mL/LCO2 培养箱中培养.将细胞稀释至 51012/L，种于24 孔板中每孔 1mL，分别与不同浓度oxLDL （0,25,50,100,2
7、00mg/L）共孵育 24h.将相同密度的 U937 细胞与 oxLDL 共孵育不同时间（0,3,6,12,24,48h）.U937 泡沫细胞形态通过新配制的3ml/L 油红 O 染色鉴定，胞质内出现红染颗粒的为脂质染色阳性.细胞膜表面 CD147 流式检测将孵育后细胞悬液，经 PBS洗涤 2 次后调整细胞密度为 1109/L.取 100L 细胞悬液加 FITC 标记的小鼠抗人 CD147mAbL，充分震荡混匀后室温避光静置 20min.经 PBS 洗涤后,再加入 300L 的 PBS.通过 FACSCalibur 流式细胞仪检测，使用CellQuest（BectonDickinson ）软件
8、分析.检测 VEGF 分泌含量按照试剂盒操作步骤,以 RPMI1640 培养基作为空白,将不同浓度的 VEGF 标准品在酶标仪（美国BIOIAD 公司出品）中检测并绘制 VEGF 标准曲线.将各组细胞离心，上清进行 ELISA 检测,通过标准曲线查得相应 VEGF含量.及 VEGFmRNA 水平检测 Trizol 提取总 RNA，以 2LRNA 作为模板进行逆转录，PCR 扩增，以 GAPDH 作为内参照.VEGF引物序列：上游 5CTGCTGTCTTGGGTGCATTG3 ，下游5GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCG3 ，扩增产物为334bp;GAPDH 引物序列上游5TCCCTCA
9、AGATTGTCAGCAA3 ，下游5AGATCCACAACGGATACTT3 ，扩增产物为 360bP.PCR反应条件：94变性 30s，55退火 30s，72延伸 30s，持续 25 个循环.CD147 引物序列:上游5ACATCAACGAGGGGGAGACG3, 下游5GGCTTCAGACAGGCAGGACA3 ，扩增产物为 480bp.PCR反应条件：94变性 30s，57退火 30s，72延伸 90s，持续 25 个循环.统计学处理：采用统计软件包进行数据分析，计量数据用 xs 表示.组间均属比较用方差分析及 Dunnettt 两两比较检验，P有统计学意义.2 结果泡沫细胞的鉴定光镜
10、下对照组细胞（U937）内无红染颗粒，而处理组细胞体积增大，细胞质内可见较多的红染颗粒，提示细胞内脂质成分增加.分子在 U937 泡沫细胞膜表面表达的变化流式细胞术显示,与对照组（U937 细胞）相比，U937 泡沫细胞膜表面 CD147 表达的平均荧光强度升高.浓度作用曲线显示，当 oxLDL 作用浓度为 25mg/L 时，U937 泡沫细胞膜表面 CD147 表达强度出现最高峰,较对照组升高约倍（P，n=3）,之后其表达强度逐渐下降（图 2）.时间曲线表明 U937 细胞与oxLDL80mg/L 作用 6h 后膜表面 CD147 表达强度出现最高峰，较对照组升高约倍（P,n=3） ，之后其
11、表达强度逐渐下降.泡沫细胞中 VEGF 的表达 ELISA 检测显示，细胞培养上清中 VEGF 的蛋白分泌含量与 oxLDL 作用浓度成正比.浓度曲线表明 U937 细胞在与 200mg/LoxLDL 作用后，VEGF 分泌水平达峰顶，较对照组升高约倍（aP，bP,n=3，图 4）.时间曲线显示，U937 细胞与 oxLDL100mg/L 作用 48h 后VEGF 分泌水平达峰顶，较对照组升高约倍（aP，bP,n=3，图 5）.及 VEGFmRNA 的表达水平 RTPCR 结果显示，当 U937 细胞与 25mg/LoxLDL 的作用后 CD147mRNA 表达水平最高，之后其水平保持不变.当
12、 oxLDL 的作用浓度为 200mg/L 时VEGFmRNA 表达水平最高（图 6）.U937 细胞与oxLDL100mg/L 作用 6h 后 CD147mRNA 表达最高，之后其水平保持不变.作用 48h 后 VEGFmRNA 表达最高（图 7）.3 讨论动脉粥样硬化是一个以修饰的脂质、单核细胞及富含胆固醇酯的泡沫细胞聚集为特征的复杂的病理过程，目前认为动脉粥样硬化也是一个慢性炎症反应过程8.在粥样斑块中，泡沫细胞不仅是一种清道夫细胞，也是一种炎症调节细胞.CD147 及 VEGF 蛋白及 mRNA 水平在泡沫细胞中的上调,提示在在粥样斑块中，CD147 及 VEGF 可能参与了泡沫细胞形
13、成的炎症反应过程9. CD147 是一种新发现的细胞表面黏附分子,又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子,可以刺激成纤维细胞的几种 MMP 的合成，参与基质的降解10.Young9等通过免疫组化在人动脉内膜粥样硬化斑块富含巨噬细胞的区域中检测到 CD147 分子.在人心衰模型中，CD147 与 a31 整合素形成复合体，通过外部信号及上调局部 MT1 ，MMP 的表达诱导 MMP 的产生从而降解基质，引发斑块的破裂促进心衰的发生.这些研究提示，CD147 分子可能在动脉粥样硬化的发生中有着非常重要的作用9.是迄今为止发现的唯一具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂作用的生长因子,并具有增加血管通透性的作用.VEGF 的增加促进了动脉粥样硬化斑块内的血管形成,由于在血管形成的过程中,细胞粘附分子等产生增加,且由此促进炎性细胞对血管壁的粘附,进而加重动脉粥样硬化,并形成恶性循环11.（作者：未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
