1、SARS-CoV S240 蛋白与眼部 ACE2 受体作用机制的研究(1)作者：孙琰，柳林，潘欣，景明【摘要】目的：研究 SARS 冠状病毒（SARS-CoV）S240蛋白与眼部功能性受体血管紧张素转化酶 2（ACE2）作用的机制。方法：构建 SARS-CoVS 蛋白融合基因 pS240-EGFP，并在哺乳动物细胞中表达；半定量 RT-PCR 和免疫组化鉴定 ACE2 在结膜、角膜中的表达；酶联免疫吸附实验、流式细胞仪检测法进行 SARS-CoVS240 蛋白与结膜、角膜细胞的体外结合研究。结果：构建了融合基因 pS240-EGFP；证实 ACE2 在结膜、角膜有表达；结膜、角膜细胞与 SAR
2、S-CoVS240 蛋白能够结合。结论：结膜、角膜中存在 SARS 冠状病毒的功能性受体，SARS-CoVS240 蛋白与结膜、角膜细胞能够结合。本研究对了解 SARS 的病理机制及进一步研究SARS 的防护和治疗具有一定的参考意义。【关键词】严重急性呼吸综合征冠状病毒 S240 蛋白受体血管紧张素转化酶 2 结合作用0 引言非典型肺炎即严重急性呼吸综合征（severeacuterespiratorysyndrome,SARS） ，具有高度传染性与致病性，其致病因子为一种新型冠状病毒SARS 冠状病毒（SARS-CoV） ，基因组结构为：5-帽状结构-复制酶（rep）-棘突糖蛋白（S）-小包膜
3、蛋白（E）-膜糖蛋白（M）-核衣壳蛋白（N）多聚核苷酸尾-3 。S 蛋白介导了病毒与宿主细胞的结合，SARS-CoV 的功能性受体是血管紧张素转化酶 2（angiotensin-convertingenzyme2-ACE2） 。本研究用 293T 细胞表达出了包含 SARS-CoVS 蛋白结合功能区域的 pS240-EGFP 融合蛋白片段，体外培养了人结膜、角膜细胞，检测了 SARS-CoV 的功能性受体 ACE2 在人结膜、角膜中的表达，并进行了非洲绿猴肾细胞（VeroE6Cell） 、人结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞与 SARS-CoVS240-EGFP 融合蛋白片段的体外结合
4、实验研究。1 材料和方法材料 SARS-CoVS（基因组原型 GenBank 登录号为：AY278554）基因片段 S（11650nt）DNA 片段。ACE2 引物序列（accessionnumberAF291820）：上游引物 5-CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT-3，下游引物 5-GAGCTAATGCATGCCATTCTCA-3，扩增片段长度为 107 个碱基。GAPDH:上游引物 5-TGGGCTACACTGAGCACCAG-3,下游引物5-AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT-3，扩增片段长度为 100 个碱基。由上海博亚生物工程公司合成。PCR 产物克隆载体pMD-
5、18T（TaKaRa 公司） ；质粒 pEGFP-N1（Clontech 公司） ；脂质体转染试剂 LipofectamineTMReagent（Invitrogen 公司） ；MammalianProteinExtractionReagent 哺乳动物细胞蛋白抽提液（PIERCE 公司） ；SABC-AP 免疫组化染色试剂盒（Santa-Cruz 公司） ；SARS 患者恢复期血清（使用前经56加热 30min 进行灭活，获自北京小汤山医院与解放军309 医院） 。主要抗体：角蛋白 KeratinPan，波形蛋白Vimentin，神经纤维丝蛋白 NFkappaB（上海友谊中联生物工程有限公司
6、） ；抗鼠辣根标记的二抗（上海华美生物工程有限公司） ；羊抗人 ACE2 多克隆抗体（R&D 公司） 。组织来源：36mo 中期引产胎儿的角膜、结膜、心、肺组织，男女不限；成人眼球破裂伤摘除的角膜和结膜组织；尸体解剖的成人心、肺、脑组织由长海医院提供。方法pEGFP-N1 及 pS240-EGFP 融合蛋白的表达 PCR 引物：SRF:5-GAATTCGCCACCATGCAGACCTCTAATTTCAGGGTTG-3（斜体为 EcoRI 酶切位点） ；SRR:5-TCTAGATTAGGGATCCATCTCGAGAGGAGTTAACACACCAGTAC-3（斜体分别为 XbaI、BamHI、Xh
7、oI 酶切位点） 。基因工程方法构建真核表达质粒 pMD-S240，进一步构建 pS240-EGFP 融合蛋白表达质粒。利用脂质体介导转染法将 pEGFP-N1、pS240-EGFP 分别转染 293T 细胞并进行克隆培养；细胞蛋白抽提液裂解细胞并进行透析，荧光分光光度计检测透析前后荧光光度值；Braford 法检测蛋白质浓度；WesternBlot 法分析基因表达产物。ACE2 在人结膜、角膜的表达体外培养人结膜上皮细胞、角膜上皮细胞、结膜成纤维细胞并行 ELISA 法鉴定。抽提组织（或细胞）的总 RNA，鉴定 RNA 纯度、浓度和完整性；半定量 RT-PCR；琼脂糖凝胶电泳；经复日紫外及可
8、见图像识别分析系统（上海复日科技公司）进行电泳条带光密度扫描，以光密度积分值比值 ACE2/GAPDH 代表 mRNA 的表达水平，实验重复 3 次，数据使用 SAS 软件包处理。免疫组化法检测组织、细胞中 ACE2 的表达（SABC 法）S240-EGFP 蛋白与各组织、细胞的结合免疫酶标技术ELISA 法：透析的各种组织及细胞蛋白抽提液与S240EGFP 蛋白进行结合试验，分别使用脑组织和 Hela 细胞及 EGFP 蛋白作为阴性对照，使用 ACE2 抗体进行阻滞研究。对所得的 A450 值进行统计分析，使用 SAS 软件包，采用析因方差分析。流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞与 S蛋白的结合
9、：检测结合后的荧光细胞。2 结果pEGFP-N1 及 pS240-EGFP 融合蛋白的表达质粒琼脂糖凝胶电泳（图 1）与 DNA 测序鉴定证明 SARS-CoVS240-EGFP 融合基因构建正确。转染的 293T 细胞在 410h 内观察到绿色荧光，12h 后可观察到明显荧光。其中 pEGFPN1 转染细胞的荧光较 pS240-EGFP 转染细胞的荧光稍强，细胞形态呈圆形（图 2） 。SARS-CoVpS240-EGFP 基因表达产物的 SDS-PAGE 及 WesternBlot 分析：相应分子质量处出现蛋白表达条带，与理论推算值相符。ACE2 在人结膜、角膜的表达培养的人结膜上皮细胞、结
10、膜成纤维细胞和角膜上皮细胞（图 3） ，ELISA 法鉴定细胞属性正确。抽取总 RNA 样品的浓度在/L 之间、完整性良好、A260/280 比值为之间的抽提样本，进行 RT-PCR。半定量统计结果认为成人肺组织、成人心组织、成人结膜组织与成人角膜组织间及 Vero 细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞与角膜上皮细胞间 ACE2-x 与 GAPDH-x 的比值间的差异有统计学意义；levene 法进行组间两两比较结果除了结膜上皮细胞与角膜上皮细胞间无显著差异外，其他各组织、细胞间均有显著差异（图 4） 。免疫组化法检测组织、细胞中 ACE2 的表达结果见文献1。S240-EGFP 蛋白与各组织、
11、细胞的结合免疫酶标技术ELISA 法：细胞及组织蛋白抽提液浓度为 10mg/L 时，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜、角膜组织的蛋白抽提液与 pS240-EGFP 蛋白出现了比较明显的阳性结合反应，与 VeroE6 细胞及心、肺组织蛋白抽提液相比稍弱；HeLa 细胞和脑组织蛋白抽提液与 pS240-EGFP 蛋白均没有出现阳性结合反应。相同浓度的上述组织、细胞蛋白抽提液中分别加入 pEGFP-N1 蛋白，均没有出现阳性结合反应。空白对照组为阴性反应。相同浓度的 VeroE6 细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、心、肺、结膜、角膜组织蛋白抽提液被 ACE2 抗体孵育
12、后，与 pS240-EGFP 蛋白没有出现阳性结合反应（图 5） 。用析因方差分析比较 S240 和 EGFP 在不同浓度（1mg/L 和 10mg/L）下与结膜上皮细胞、Vero、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、HeLa 的结合能力，结果显示：S240EGFP 的结合能力比EGFP 强，均数分别为， ，10mg/L 浓度比 1mg/L 浓度结合能力强，均数分别为， 。在比较的各种细胞中，Vero 的结合能力最强，均数为，结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的结合能力相当，均数分别为：， ， ，HeLa 的结合能力最差，均数为。经过比较，以 10mg/L 浓度的 S240 与Vero 的结
13、合能力最强，均数标准差为。用同样的方法比较 S240 和 EGFP 在不同浓度（1mg/L 和 10mg/L）下与心、肺、结膜、角膜、脑 5 种组织的结合能力，结果如下：S240 的结合能力比 EGFP 强，均数分别为， ，10mg/L 浓度比1mg/L 浓度结合能力强，均数分别为， 。在比较的各种组织中，心、肺组织的结合能力最强（二者无差异） ，均数分别为， ，结膜组织和角膜组织的结合能力为其次（二者无差异），均数分别为：， ，脑组织的结合能力最差，均数为。经过比较，以 10mg/L 浓度的 S240 与肺组织、心组织的结合能力最强，均数标准差分别为，。流式细胞仪检测结果显示：从细胞荧光指数观察，VeroE6 细胞、结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与 pEGFP-N1 蛋白均没有明显的结合；VeroE6 细胞与 pS240-EGFP 蛋白出现了较明显的结合，结膜上皮细胞、结膜成纤维细胞、角膜上皮细胞与pS240-EGFP 蛋白也表现出一定的结合，但较 VeroE6 细胞明显要弱；上述细胞预先被 ACE2 抗体孵育后，与 pS240-EGFP蛋白的结合明显被阻滞；而 ACE2 同种异型抗体没有能够阻滞上述细胞与 pS240-EGFP 蛋白的结合（图 6） 。（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
