1、多聚酶链反应（PCR）在法医生物学检材鉴定中应用及前景?98?黑龙江医药科学 2004 年 6 月第 27 卷第 3 期多聚酶链反应(PCR) 在法医生物学检材鉴定中应用及前景王抒,孟庆媛,郭梦凡,金玉珍,高祥亭,袁德新(佳木斯大学基础医学院,黑龙江佳木斯 154007)摘要:目的:耙多聚酶链反应(PCR)应用在法医生物学检材中进行遗传标志的分型检测.方法:运用体外 DNA 扩增技术,选择不同的耐热 DNA 聚合酶,改进缓冲液成分及循环条件等.结果:已迭到接近个体绝对认定.结论:如果找到一种能停留在模板 DNA 链上相对更长时间,合成速度更快的 DNA 聚合酶,将进一步推动(PCR)的发展.关
2、键词:多聚酶链反应;PCR;DNA 聚合酶;法医学中图分类号:D919.4 文献标识码:A 文章编号:1008 一 O104(2004)03009801多聚酶链反应(PCR) 是一种体外扩增 DNA 技术1.目 100.C 条件下 100Kb 内每分钟可出现 1 个损伤点.PCR 所用前该技术主要用于扩增数百个到上千个碱基对(Kb)的 DNA 的 TrisHC1 缓冲液其温度系数为一 0.03 单位.在 25条片段.法医物证学的鉴定客体主要是生物学检材,其形式是件下,pH 为 8.55 的缓冲液在 95时,pH 会降至 6.45,这种多种多样的:如在各种载体上的血痕,精液与阴道液的混合低 pH
3、 值会导致更快的损伤,这种损伤会严重限制 PCR 扩增斑,毛发,骨组织,被害人指甲缝中残留的组织成分等.对这产物的长度.些检材进行检验的主要目的就是根据检验结果确定该生物 2.1 循环温条件学检材的个体来源.以往所用的检验方法主要包括红细胞血型和蛋白质遗传标记分型等检测方法.现在我们可以在DNA 水平上对有关生物学检材进行遗传多态性的检验,因为每一个体从遗传学上来看都是独一无二的,在 DNA 水平对生物学检材进行遗传标记的分型检测,可达到接近个体绝对认定的结果.在法医学领域,PCR 技术在个体识别,亲子鉴定中得到广泛应用.它有如下特征:可以扩增极为少量的DNA,理论上讲,可少至一个细胞内的 D
4、NA,从而能极大地提高微量检材在法医物证学鉴定中的价值.PCR 技术操作简便,检测时间短.上述优势使得 PCR 技术能够在较短时间内在法医物证学中得以广泛应用,并成为主要的检测手段.在实际应用中,只有扩增更长的 DNA 片段才有价值.而这又受到选择不同的耐热 DNA 聚合酶,改进缓冲液成分及循环条件等因素的影响 HJ.1PCR 中的 DNA 合成的忠实性人们容易考虑到制约 PCR 产物长度的因素往往是两引物问的距离,模板二级结构的形成及聚合酶活性等.而制约因素主要有两个:即产物序列的忠实性和产物的分子量大小.忠实性是指扩增过程中碱基是否错误装配导致低效延伸.用常规 PCR 扩增一段 2Kb 的
5、细菌 Kb 基因对时,PCR 不起作用,检查原因发现,所用引物 3 一末端本应是碱基 T,但错为碱基 A,故和模板间 AA 不能配对,导致 PCR 的失败.后将耐热 DNA 聚合酶 KlentaqI 改用 3 一末端,校正性的 Pfu 聚合酶,以纠正引导物末端的错误,试验也同样失败 .原因是单独使用 Pfu 或其它具有 3一端外切酶时可以引起引物降解,使扩增无法完成,尤其在需要长时间延伸时更是如此.最后将 KlentaqI 和低浓度的 Pfu 结合使用,效果良好.试验启示,既然引物末端错误可以终止 PCR 反应,在PCR 扩增长序列 DNA 片段时引物延伸过程中出现的错配是否具有类似情况? 解
6、决办法是使用低浓度的具有 3端外切活性的酶来校对正延伸过程中的错误,而用另一种聚合酶(KlentaqI)来完成延伸.KlentaqI 和 Pfu 的合适比例约16:1,这种组合条件下从入噬菌体中扩增出长度达 35Kb 的DNA 片段,其长度接近为人载体最大克隆片断的两倍,除上述两酶的组合外,其它类似的酶的组合也具有同样效果,目前的组合中有使用 Taq,rTaq,rTth,Tub,KlentaqI,和 3一端外切活性的 Pfu 为主要聚合酶,以 Pfu,Pwo,Deepvent 和vent 为较正确.2PCR 中模板 DNA 的损伤在用 PCR 扩增 DNA 片段中除错配因素外,模板 DNA的损
7、伤是另一个重要影响因素.长模板中会有更多的位点对循环升降温敏感而断裂.随 PCR 循环温度上升,在 pH7.0,作者简介:王抒(1963) 女 ,黑龙江佳木斯人,副教授.在扩增12Kb 的 DNA 片段时尽可能降低变性温度和缩短变性时间,9294下 510 秒即可.可以采用二步法,94短时间变性后 68复性和延伸,高复性的温度可减少二级结构带来的影响,但 68延伸的时间不能低于 56rain,否则产物量降低.rTaq 酶和 rTth 酶在标准 PCR 条件下每秒钟合成速度可达 6O 个碱基.对扩增 20Kb 的靶序列,复性延伸时间至少 10rain,但每循环不能超过 2min,如在每循环的延伸
8、中自动追加 152O 秒可提高反应的特异性,进一步减少非特异性的产物.2.2 改进缓冲液体系Trieine 的温度系数小于 Tris 更和适.对 Tth 聚合酶,2O25mmol/L.Tricine 缓冲液(25,pH8.58.7)较好.低K 水平可以增加这些酶的活性,但同时降低了特异性 .在无校正酶组合情况下则 Mg 浓度在 1.72.0mmol/L.在有校正酶的情况下 Mg“总浓度在 1.O1.25mmol/L.引物长度和浓度未见明显影响,一般用 2O25mer,52 6O%G+C的引物.对高拷贝模板使用 0.40.5umol/L 引物,对低拷贝模板使用 0.150.2umol/L 引物.
9、2.3 加入辅助试剂补加甘油可以保护聚合酶的稳定性.8 的甘油使标准PCR 反应提高 1OKb,而补加二甲亚矾(DMsO) 比单独使用甘油更有效.甘油和 DMsO 具有降低变性温度和缩短变性时间的作用,以减少 PCR 对模板的损伤.PCR 仍是处于发展和完善中的技术,它的普及应用仍受到一些限制,这些限制包括设备条件,试剂及方法学问题.目前,关于影响 PCR 扩增的关键问题应该是 DNA 聚合酶.因该酶在 DNA 链上催化合成一定时间后便脱离,影响了产物长度.如找到一种能停留在模板 DNA 聚合酶,将是进一步推动 PCR 发展的重要因素.由此可见,无论是关于 PCR 的机理方面,还是技术应用方面
10、,今后仍有许多工作要做.参考文献:1王伯纭,李玉松 ,黄高升,等主编.病理学技术M.北京:人民卫生出版社,2000,574582李玉林主编.分子病理学M.北京:人民卫生出版社,2002,1201223SinLLp,WongKF,ChanJKC,eta1.Comparativegenomichybridizationanalgsisofnaturalkillercelllymphoma/rukemiaJ.AmJPathol,1999,155(3):1419414254张建中.DNA 芯片技术及其在病理学研究中的应用前景J. 临床与实验病理学杂志,2000,16(2):3244325(收稿日期:2OO4 一 O527)
