1、基因突变的检测,一、突变类型 营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或者自然突变失去合成某种营养（氨基酸，维生素，核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，成为营养缺陷型。营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。 抗性突变型：野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物、致死物理因子或噬菌体的抗性变异类型。他们可在加有相应药物、用相应物理因子处理或含有噬菌体的培养基平板上选出。例如对一些抗生素具有抗药性的菌株等。,细菌真菌和病毒基因突变的检测,条件致死突变型：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常的生长繁殖并呈现其固有的类型，而在另一种条件下却无法生长
2、、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。形态突变型：由突变引起的个体或菌落形态的变异，如细菌鞭毛或荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子有无或颜色变化，细菌产可溶性色素的变化、菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌体的大小或清晰度等的变化。抗原突变型：由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的 变异类型。产量突变型：通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变体，称产量突变型。,营养缺陷型菌株法（Ames试验） 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，包括碱基置换突变型和移码突变型，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变
3、剂作后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，其中的酶能使一些前诱变剂转变为诱变剂，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。,淘汰野生型法 抗生素法青霉素可抑制细菌细胞壁的合成，是新分裂的细菌细胞不能合成新的细胞壁，这样分裂的细菌细胞就处于部分原生体状态。在培养基的低渗条件下就可能破裂死亡。经诱变处理的细菌在添加青霉素的基本培养基上培养几个周期，其大量生长的野生型细菌会因细胞分裂，新的细胞壁合成被青霉素抑制而处于原生体状态，低渗破裂而死亡，而营养缺陷型因其生长营养物质自身不能合成，又不能在基本培养基中获
4、得，因而并不发生分裂，青霉素也不能对其发挥作用。这样发而存活下来，经几个细胞周期后，收集菌体，再经完全培养及培养，负选择法筛选就可获得营养缺陷型突变。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型的作用。,菌丝过滤法真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔34h过滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释、涂皿分离。高温
5、杀菌法利用芽孢杆菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异，让诱变后的细菌形成芽孢，然后把处在芽孢阶段的细菌移到基本培养液中，振荡培养一定时间，野生型芽孢萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。,夹层培养法先在培养皿上倒一薄层基本培养基，凝固后再倒一层经过诱变处理的菌液，其上再浇一层基本培养基；经培养后，对首次出现的菌落用记号笔在皿底标记，然后再倒一层完全培养基，再培养，出现的形态较小的新菌落，多为缺陷型。 噬菌斑法 利用宿主范围、生长速度、噬菌斑大小、形态等性状可对病毒进行突变的检测。大肠杆菌T4噬菌体快速溶菌突
6、变体就可导致受体细胞快速裂解，形成大而透明的噬菌斑，根据在不同大肠杆菌品系中的表现，又可细分为、三种不同的突变体。有些病毒基因发生突变后不但可以改变其宿主范围、繁殖速度、毒性也可能发生改变。,局限性转导 温和噬菌体感染受体菌后，其染色体会整合到细菌染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，例如噬菌体，其插入位点的二侧分别是gal和bio基因；如果该溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因，（对噬菌体分别是gal和bio基因），会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，由此产生了一类特殊的噬菌体-缺陷噬菌体，缺陷噬菌体除含大部分自身的DNA外，缺失的基因被几个位于前噬菌体整
7、合位点附近的宿主基因取代，这样形成的杂合DNA分子在宿主细胞内能够象正常的噬菌体DNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。但该缺陷噬菌体没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。,果蝇突变体的检测,CIB法果蝇有一个品系称l系,可以检测到X染色体上的任何致死突变或其他非致死突变，染色体上有一个大的倒位；隐性致死突变；显性棒眼基因。由于基因而使雄果蝇不能存活，基因可作为标记，凡带有lX染色体的雌果蝇可以从棒眼性状上加以辩认，大的倒位可以抑制lX染色体与另一同源染色体交换。检测的方法是让受检的雄果蝇与l雌果蝇杂交，所生子
8、代应为：。在雌蝇中有半数带l，可以从棒眼上加以辩认，在这些棒眼雌蝇中的两条染色体，一条是l，另一条是受检雄蝇来的染色。将这一棒眼雌性与正常雄性单对交配，观察子二代的性状。,Muller-5法 Muller-5品系，是人工创造的一个果蝇品系。它的X染色体上带一个棒眼基因B，一个杏色眼w和一个倒位区段。倒位区段的存在可以抑制杂合体的交换重组。用经诱变处理的雄蝇，与Muller-5品系雌蝇杂交，得到子一代后再做单对交配，看F2代的分离情况。如有致死突变，子二代中没有野生型雄蝇，如有隐性的形态突变，则除Muller-5雄蝇外，还可出现具有突变性状的雄蝇。（如图所示） 这个技术的缺点：1只能检出完全致死
9、的隐性基因。2有时Y染色体上有些正常作用的基因可能降低X染色体上的致死效应，给结果带来误差。 这个技术的优点：1子二代中有野生型还是没有野生型可以客观地决定。2致死基因存在于子二代杂合体蝇中，供进一步研究使用，而不会马上丢失。3可研究致死基因（e）在杂合体中的作用。4同样的方法可以检测隐性可见突变。,并连X染色体法可以检测出X染色体上的隐性非致死突变，该法用一种特殊的雌果蝇为一有两条紧密相连并不分离X染色体称为并连X染色体及Y染色体构成的XXY果蝇。该果蝇可正常生活并产生两种（XX或Y），再经诱变处理的雄果蝇交配后，所得的雌果蝇为XXY，可正常生活，3X超雌不能成活，另一半雄果蝇的表现就与诱变
10、的效果直接相关，可能表型正常，突变及死亡。,常染色体突变的检出 平衡致死法可检出常染色体上的突变基因。例如果蝇在第二染色体上有一个Cy基因（Curly，卷翅），这个基因对正常翅是显性的，但在致死作用上却是隐性的。同时在这条染色体上还有一个大的倒位，Cy在倒位段内，以抑制重组的发生。在其同源染色体的另一成员上有一个显性突变基因S（star，星状眼），也是纯合致死的。所以这个品系是一个平衡致死品系。品系内个体间相互交配之后，只出现一种与亲代完全一样的后代Cy+/+S，其表型是卷翅、星状眼。利用这样的永久杂种检测第二染色体上的突变基因时，先将该品系的雌蝇和待测的雄蝇杂交，在F1挑选卷翅雄体再与该品系
11、的雌体作单对交配，分别饲养。在F2选取卷翅的雌雄个体相互交配，到F3可出现以下情况（图16-14） （1）如被检测的第二染色体不带有致死突变，则有1/3左右的野生型出现。（2）如被检测的第二染色体带有致死突变，则全部是卷翅果蝇。（3）如发生可见的隐性突变，还有1/3左右的突变型。,人类突变的检测,系谱分析：对于常染色体显性遗传，特别是显性完全时，其突变比较容易检测；而对常染色体隐性遗传的基因突变，由于不能判断隐性性状是由于两个杂合体婚配，还是隐形突变的结果，因而难以检出。如果某一显性突变先证者，其父母均为正常，二期显性性状可规则的遗传给其后代，则可推断该先证者的父母一方在形成配子时可能发生了显
12、性突变。如果遗传不规则，其父母有一方可能是该基因的携带者但不表现，因而并比一定是基因突变的结果由于人的性别决定为XY型，X染色体上许多基因在Y染色体上并无等位的基因，因而不论是显性还是隐形在男性中X染色体上的基因大多数均可表达。如果有一男性先证者，表现某X-连锁隐形突变性状，则其母亲提供的X染色体有一定突变基因。如果母亲表型正常则可能是杂合体或是产生的卵子发生了突变，如果该母亲所生其他子女均无该突,变性状，则可以肯定先证者所接受的其母亲的X染色体是X连锁隐性突变的结果，如果该母亲所生子女有一半具有该突变性状，则肯定是携带者而并非突变之故。由于一个家庭人数较少，这种分析仍有很大的局限性和误差。
13、PCR技术在突变基因检测中的应用 从广义的角度来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。（一）点突变的PCR直接检出,当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物，然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，EB染
14、色，紫外检测仪下检测有无特异性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失. 一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR，然后琼脂糖凝胶电泳及EB染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避免因某些原因引起的扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应用PCR技术进行X地贫Bart基因胎儿水肿综合征义基因缺
15、失检测时，常用一对引物扩增缺失区域，同时同一对基因引物扩增基因的一个片段，然后电泳检测.若同时即有和基因的特异性扩增产物，若无基因的扩增产物则说明模板DNA中有 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征.,多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如， 则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可
16、行的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺失的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变. 用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检测. 单链构象异构多态分析技术（SSCP）,RNA 单链钩象多态性检测（PCR-rSSCP） 双脱氧测序单链片段构象多态性分析（PCR-ddF） 限制性内切酶指纹技术（PCR-REF） 该方法的原理是基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同
17、，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时其泳的位置亦发生变化而表现出不同序列单链其电泳迁频率的差异，从而据引判断有无突变存在.对于一段DNA来说，其单链具有特定的空间构象，这种空间构象的形成与该段DNA的碱基序列有关，当这段DNA发生突变，基碱基序列亦发生相应的变化，空间相象亦随之改变，研究发现，不同空间构象的DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时的迁效率有所不同，这样对于同一段单链DNA来说，这种空间构象的变化及电泳迁移的改变即能说明其有突变的发生因此，可用经PCR扩增的DNA片段经变性成单链然后在中性胶中电泳，即可检出有无突变.,限制性片段长度多态性（RFLP） 直接检测限制性内切酶切点的变
18、化PCR产物酶解分析 PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变-包括所增加的酶切位点及原有的酶切点消失的单碱基置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的片段进行对比分析即可确定有无酶切位点的改变.比如镰状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变，正常情况下靶DNA的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。用引
19、方法检测突变快速可简便，但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关，因此其应用受到限制，反能检出点突变的极少一部分。,3特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.在PCR扩增时，引物的延伸是从其3未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期 的扩增产物，若引物3端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物，基于以上事实，可利用3端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的突变位点，此即3特异PCR，扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个PCR扩增反应，有两对引物但它们的3端有差异，一为正常引物，
20、另一为3端突变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而突变的引物只与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结果。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体，在这种情况下，同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应. 尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3-特异PCR，可攻DNA分子上的多位点变化的鉴定准确快速，简便。,PCR直接测序 DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法，它不仅可确定突变的部队，而且还可确定突变的性质.PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析，而不是家传的测序技
21、术先将DNA待测片段克隆于测序载体上，这不仅大大的简化了操用步骤，节省大量的人力和物力，而且可实现自动化操用，加之新的荧光检测技术的应用，使测序的效率大大提高. 采用PCR循环直接测序时，应首先将扩增产物转化为单链测序模板，目前常用的转化方法为不对称PCR，即在反应体系中引物浓度的差异来形成单链DNA，通常侧引物 的浓度为1001.当某一引物被耗尽后，另一引物扩增的片段即为单链然后即可用于测序，此外，获得单链DNA还有磁珠俘获法，外切酶消化法，PCR直接测序的最新发展是将双脱氧络子技术与PCR技术相结合进行循环测序，在PCR反应体系中同时将ddNTP加入，并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增
22、后，得模板的扩增与测序同时进行，其特异在于使用的模板量小且不需分离单链.,PCR-寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASb) 如果一个基因的突变部位，性质经测序分析已经阐明，即可用该方法直接检测突变.该方法的原理即利用人工合成的寡核苷酸片段作为探针，与经PCR扩增获得的靶DNA进行杂交，在严格控制杂交条件的前提下，通过斑点杂交式其它类型的杂交来检测PCR产物中有无对应突变，即探针与靶DNA片段之间只要有一个碱基不相互配对或错记，就能检出. (1)探针一般合成两个，一个为正常序列，另一含有突变位点，前者与正常靶DNA完全互补，后者只与突变DNA互补，该探针称之为等位特异寡核苷酸探针(ASO探针).
23、(2)杂交类型，传统的PCR-ASO技术主要是将PCR，占物固定于杂交膜上，然用不同的标记探针检测，亦有将已标记好的探针预先固定于杂交膜上，再使之与PCR产物结合，检测有无完全互补的DNA产物. (3)探针的标记，最先应用的标记物为放射性物质有32P，34S，半衰期及放射性危害不能普遍应用.PCR技术的引进使可在短时间内获得足够量的靶 DNA片段，因而对探针的要求亦有的降低，因非同位素标记的探针亦可获非常满意的结果，它不仅使ASO探针使用起来更简便，而且无同位素半衰期的限制，操作亦更安全，适合于临床应用.目前已用PKU，地贫杂的基因突变检测.,异质性双链构像多态性分析（HTX） 在同一扩增体系
24、中，若同时含有正常模板和突变型模板时，随着PCR的循环进行，野生型基因片段和突变型片段均可扩增，并形成了异源双链，由于异源双链中未配对区的出现，因而其空间构型亦发生改变，这机型上的差别即形成电泳图谱上的差异，这种方法适合于较小DNA片段的分析，一般在300bp以下，其敏感性与SSCP相似，该技 术简便，适用于快速的突变检出，已用于多种遗传病基因突变的研究. 随机扩增多态性DNA 随机扩增多态性DNA(RAPD)将通常PCR反应中使用的两个特定序列的引物改为单一的由10个碱基构成的随机引物，并运用大量的不同序列的随机引物进行扩增，使基因组DNA多态性充分展现出来。由于RAPD技术允许在事先未知D
25、NA序列的情况下检测基因组中存在的多态性，大大方便和拓宽了对基因组DNA变异的研究，而使这一技术一出现就首先被用于分子系统学研究中。另外，由于RAPD技术可以在一次反应中检测基因组的多个位点，能快速寻找两组或多组DNA样品间的多态性。,变性梯度凝胶电泳(DGGE) DGGE是检测基因突变故为精确的方法，它不仅可检测单一片段的单点突变，对多点突变的检测亦较容易，该方法与PCR技术相结合，使其能非常快速的对大量标本进行分析. 对于一DNA片段来说，其Tm值与基碱基组或有关，当其碱基组成发生变化时，Tm 值亦改变，因此，对于突变的片段来说，若其在一变性物质线性梯度增加的凝胶上进行电泳时，随着变性剂浓
26、度的增加，当这种浓度达一定值时突变的DNA片段发生解链而形成分叉，其电泳迁移速度变慢.因此突变的DNA片段与正常的DNA片段电泳的迁移位置有差别，研究证明DGGE可检出任何类型的单碱基取代，如果将突变型与正常的DNA片段形成异源双链时，其敏感性大大提高. 恒定变性胶电泳(CDGE) CDGE是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中的含的变,性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增.为了提高DGGE和CDGE的检测敏感性，通常在一侧引物的5端设计一含GC的区域，避免了
27、DNA的完全解链，从而提高了突变的检出率，可达100%. 温度梯度凝胶电泳(TGGE) 该方法是将PCR扩增的产物量一中性聚丙烯酰胺凝胶上，在一温度线性梯度上升的电场中进行电泳，当DNA双链到达其Tm时，双链解开，形成分叉，而影响电泳迁移 率，突变的扩增产物其Tm值与野生型有明显不同，因而有不同的解链区，从而造成电泳迁移效率的差别，据此可判断检材中DNA有无突变. 除上述的几种以PCR为基础的突变检出技术外，还有错配碱基化学裂解法，PCR产物的RNA酶检出法及引物竞争法用于基因突变的检出，化学裂解法以期敏感性高，检测片段长而应用更为广泛.,总之，以PCR技术为基础建立的基因突变检测技术有多种，
28、而且各有其优缺点，但目前较为广泛应用的为PCR-SSCP，PCR-ASO及PCR循环直接测序。 从基因表达产物入手，进行间接检测基因突变的方法，如蛋白质截断实验（PTT），体外合成蛋白质测定（LVSP近来发展应用于与人类疫病有潜在联系的基因突变的检测运用这一试验。几种基因突变，包括剪切点变换、框外缺失、插入突变和大于 25hp的框内缺失以及无义夹变都可在大片段cDNA中快速而敏感地分析出来，使用了一个包括RNA聚台酶启动子和真核生物翻译起始信号在内的上游PCR引物，这一经修饰的引物允许 PCR产物进行转录和翻译合成的多肽通过 SDS 聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分析。蛋白质在大小上与野生型相异直接反
29、映了一个突变影响重要蛋白质的长度。S 标记的蛋氨酸或其它放射性氮基酸的结合已被用于通过电泳探测翻译产物。,植物及其他动物突变体的检测,植物突变体的检测表型鉴定 表型鉴定是以诱变育种和基因功能研究为目的的突变体筛选最常用的方法。要求必须有能遗传的 、相对于野生型有显著差异的外观性状 ，一般也包括逆境筛选和化验分析筛选。表型鉴定的方法虽然简单易行 ，不需要特殊的硬件设备 ，但是在突变体鉴别方面的作用是很有限的。细胞学鉴定 这个层次的鉴定一般以研究诱变的机理及诱变因素的靶标为目的，主要通过观察细胞及细胞器形态的变化 、染色 体异常的变化 ，研究诱变的作用机理和效果。张月学等 对卫星搭载的2种苦荚菜种
30、子 SP 代根尖细胞染色体变异进行了研究 ，表明太空环境诱变处理后提高了苦荬菜种子的根尖细胞有丝分裂指数 ，出现了包括微核 、染色体桥、染色体断片等在内的多种类的染色体变异 。,生物化学鉴定 对于数量性状的变异，往往很难区分这种变异是由遗传物质的改变造成的还是由环境造成的。可以从生理生化的角度对突变体作进一步的分析。有学者用 SDSPAGE技术从一批大豆品质突变体中筛选出 3个种子贮藏蛋白发生变异的稳定突变体 ，并发现其中一个突变体比其野生型亲本的蛋白质谱带多一个小带，从而把该突变体和其野生型亲本区分开来 。 分子生物学鉴定 主要鉴定基因组中酶切位点、引物结合位点或PCR扩增产物片段大小的变化
31、 ，从分子层次挖掘突变体 ，确定突变频率 。这种方法直接从 DNA水平上进行分析 ，因此又 叫 DNA分子标记。分子标记技术用于突变体鉴定的主要优点在于：突变位点直接以 DNA 的形式表现 ，在植物体的各个组织 、各发育时期均可检测到，不受季节环境限制 。缺点是找到的突变位点可能没有相应的表型功能缺失 ，或者找到多个突变位点后 ，不能确定到底哪个位点和缺失的功能相关 ，只能说明诱变材料从DNA水平上发生了变化以及突变发生的频率。,其他动物突变体的检测 显性致死突变法，用待测物质处理雄性小鼠，使处理的雄鼠和未处理的雌鼠交配，观察母鼠子宫中的死胎数，死胎数愈多则说明诱发的显性致死突变愈多。这一方法
32、适用于慢性处理，其优点是可靠性较大，而且测试对象是哺乳动物。缺点是不能区别出药物对遗传物质的诱变作用和对于胚胎发育的其他毒理效应。 隐性突变法，一般采用某些隐性突变基因呈杂合状态的动植物作为测试对象，如果经某种药物处理后出现这一隐性性状，便说明这一药物诱发了这一隐性突变。小鼠中有多个隐性突变基因呈杂合状态的品系，可以用它来同时测定几个座位上诱发的基因突变。这一方法的优点是所测得的是哺乳动物中的基因突变，缺点是灵敏度较低，而且必须具备特殊的动植物品系,实验周期也较长。,中间宿主扩散盒法，为了能使回复突变法更接近于哺乳动物活体中的情况，有人把测试的细胞放在一种特制的小盒中，小盒的膜只允许溶液通过。把这种小盒埋藏在动物腹腔内，用待测物质处理动物，经过一定的时间后把小盒取出，测定小盒中被诱发回复突变的细胞数,谢谢,
