1、,重组hCG乳酸杆菌对小鼠阴道粘膜免疫的效果,李大金 复旦大学妇产科研究所,避孕疫苗：安全、方便、不影响生殖内分泌 精子抗原、 hCG 、卵透明带、FSH Talwar, hCG-HSD疫苗 有效：50ng/ml hCG结合力 可逆： 35ng/ml, 内源性hCG无免疫原性 有效率：80-85% 原因：载体；免疫途径 系统免疫(1/10)、粘膜免疫,研究现状:,抗原,Dome,T cell zone,B cell zone,Surface IgA+ B Activated B Resting B,CD4+ T-nave CD4+ T activated CD4+ T memory CD8+
2、CTLs,MALT,血液,归巢,粘膜效应部位：,胃肠道 上呼吸道 泌尿生殖道 腺体,M cell lympoepithelium,共同粘膜免疫机制,活疫苗载体在粘膜部位持续表达抗原 细菌/ 病毒减毒株：减毒沙门氏菌、Bordetella pertussis，呼吸道合孢病毒等 细菌/ 病毒减毒株有潜在致病能力乳酸杆菌是人体正常菌群，具有GRAS(generally regarded as safe)特性,阴道、肠道常驻菌，拮抗致病菌 在粘膜局部定居并持续表达抗原 避免体细胞表达抗原时可能的基因突变 方便、易于接受用乳酸杆菌在生殖道局部表达外源蛋白并刺激产生抗原特异性抗体 至今未见报道,乳酸杆菌表
3、达抗原经粘膜免疫,可用乳酸杆菌表达多种细菌蛋白： 几丁质酶，噬菌体胞壁水解酶，果聚糖酶，超氧化物歧化酶 S-层蛋白表达信号 获得了240mg/L表达效率膜锚定序列将目的蛋白锚定在胞膜上从未表达过哺乳动物功能蛋白,乳酸杆菌基因工程的发展,G细菌,不存在周质空间，可直接从上清中获得分泌性表达的目的蛋白,优势,劣势,不易裂解，质粒抽提效率低,外源基因导入困难(不接受连接混合物；需大量纯化的质粒：电转一次，500ng),无商品化的工具,乳酸杆菌基因工程的挑战：,整合型表达载体pIlac、表达菌Lb casei CECT5276,优点： 可在大肠杆菌中高拷贝的扩增，便于基因克隆；获得大量纯化质粒，使得转
4、化方便 介导外源基因整合入宿主菌的基因组中，稳定表达；红霉素耐药基因可自发缺失，安全,TAAAAAGGAGGCTGCAGCATATGCCCGGGGAATTCAATCGGAGGGAATG,RBS PstI NdeI SmaI EcoRI,LacF,LacG,ori,Ap,Em,pIlac 4895bp,基因组DNA,基因组DNA,基因组DNA,目的基因,目的基因,Ery,Ery,目的基因,目的基因,pIlac,pIlac,研究目的：,构建乳酸杆菌hCG 稳定表达株乳酸杆菌在小鼠阴道内表达hCG抗原经阴道免疫小鼠，以在生殖道局部刺激产生抗hCG抗体,第一部分,hCG抗原在乳酸杆菌的分泌性表达,构建
5、质粒pIlac-hCG ,电穿孔转化乳酸杆菌,获得重组hCG 乳酸杆菌稳定表达株,技术路线:,PCR扩增670bp片段并测序,与hCG基因连接,PCR扩增信号肽+ hCG,将信号肽+ hCG克隆入pIlac,得到 pIlac hCG,pIlac-hCG 的构建:,EcoRI KpnI,670bpS-层蛋白表达信号,pUC18,KpnI,BamHI,XbaI,HindIII,EcoRI/KpnI双酶切,pUC18A,EcoRI,KpnI,PCR,Lb DNA,连接,EcoRI,S-层蛋白表达信号,扩增670bp的S-层蛋白表达信号,S-层蛋白表达信号序列测序及blast 结果,agctgaagc
6、agtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatttttcttcctccaaacataaaatatgc gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatctttcttcctccaaacataaaatatgt aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaaatttattcga aatt
7、tatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaattttatttca taacatcagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taacattagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taaggagatacaaggattacgccctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtatcct taaggagatacaaggattacgctctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtgtcct
8、 gtaatgttattgttacataactaaaagtctactaacctgcttaaagcctttgtaa gtaatgttattgttacataactaaaacgtcactaacctgcttaaagcctttgtaa,扩增S层蛋白信号肽序列hCG,HindIII,BamHI,hCG,KpnI,pUC18A,EcoRI,KpnI,BamHI,S-层蛋白表达信号,pBShCG,KpnI BamHI,hCG,EcoRI,BamHI,S-层蛋白表达信号,hCG,连接,KpnI BamHI双酶切,NdeI 信号肽 hCG EcoRI,PCR,S层蛋白信号肽序列hCG融合产物测序及blast分析,
9、与S-层蛋白序列比较：,atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 103 atgcaatcaagtttaaagaaatctctttacttgggccttgccgcattgagctttgctggt 327 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 133 gttgctgccgtttcaacgactgcttcagct 357,agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 237 agacaaggcaggggacgcaccaa
10、ggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 60 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 297 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 120 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 357 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 180
11、 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 417 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 240 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 477 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 300 cccgcgcggcgtgaaccccgtgggtctcctacgccgttg
12、gctcttagctgtcaatgtgca 537 cccgcgcggcgtgaaccccgt-ggtctcctacgccg-tggctctcagctgtcaatgtgca 358,与hCG序列比较：,NdeI 信号肽 hCG EcoRI,pIlac,P,SD,PstI NdeI SmaI EcoRI,NdeI/EcoRI,ligate,pIlac hCG,P,NdeI,EcoRI,信号肽 + hCG,pIlac hCG的构建,pIlac质粒在不同电压下的转化效率,pIlac hCG和pIlac 的转化效率比较：,1200v 1500v,乳酸杆菌基因组hCG整合基因鉴定,2000 750 50
13、0 250 100,Lb. casei hCG分泌性表达动态变化,乳酸杆菌表达hCG的分布,重组hCG乳酸杆菌培养上清免疫印渍分析,97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa 14.4 KDa,红霉素耐药基因的重组缺失及建立稳定表达株,在无红霉素的MRS传50代后,在5g/ml红霉素的MRS平板上无生长 而未经传代的细菌可生长 说明红霉素耐药基因已自发缺失,Lb. casei hCG稳定菌株体外分泌hCG动态观察,外源基因hCG整合对 Lb. casei 生长状态的影响,外源基因hCG整合对 Lb. casei培养上清pH值的影响,葡萄糖对乳酸杆菌hCG表达的影响,
14、乳糖对乳酸杆菌hCG表达的影响,pH值对乳酸杆菌hCG表达的影响,在无选择压力下培养50代并经2次冻存、复苏后，上清中hCG浓度仍可达到 250 mIU/ml 红霉素耐药基因已自发缺失，可安全地应用于人体 更有效地裂解乳酸杆菌 较简便的电穿孔方法: 105转化子/ugDNA S层蛋白信号肽序列引导分泌 为用乳酸杆菌在阴道内表达功能蛋白奠定了基础,Lactobacillus casei CECT5267稳定、分泌、高效表达了hCG蛋白：,小结1：,第二部分,表达hCG的乳酸杆菌对BAL B/c小鼠阴道免疫及其免疫效果,免疫印渍鉴定hCG蛋白:,97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa
15、 20.1 KDa 14.4 KDa,转染COS-7细胞：180mIU/ml,Lb. casei hCG经阴道免疫产生 抗hCG IgA抗体,109,108,107,109,Lb. casei hCG,Lb. casei pIlac 阴性对照,DNA免疫或经阴道免疫在阴道粘膜免疫效应,hCG特异性外周淋巴细胞体外增殖试验,外周免疫活性细胞在hCG抗原刺激下 IFN-和IL4分泌,粘膜免疫在对抗病原体入侵中发挥重要作用 脊髓灰质炎口服疫苗；伤寒、霍乱、流感、HIV 粘膜免疫途径：口服、喷鼻、阴道接种沙门氏菌表达精子抗原用于免疫避孕（潜在致病能力） 乳酸杆菌表达抗原用于免疫避孕未见报道,讨论：,重组菌可在阴道粘膜局部定居并分泌hCG抗原 经阴道免疫可在阴道粘膜局部产生hCGIgA抗体 阴道粘膜免疫可以诱导外周免疫活性细胞特异性免疫记忆 最佳免疫剂量：109或108重组菌乳酸杆菌表达抗原经粘膜免疫，可建立一种安全、有效、方便的避孕疫苗免疫新途径,本研究证明：,乳酸杆菌基因工程的重要经济价值 重组乳酸菌粘膜免疫的应用潜力 为免疫避孕疫苗实际应用研究奠定了基础下一步工作：增强免疫效果 调控阴道局部条件使重组菌表达效率增高 将hCG抗原偶联佐剂、IFN-增强免疫原性 将抗原锚定于乳酸杆菌胞膜表面,展望:,谢谢!,
