1、1 创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.1降钙素原通过影响磷酸化蛋白激酶C、闭合蛋白表达损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能刘慧恒，王隽笙，林锦洲，郭梦雨，胡婷（厦门大学附属中山医院急诊部，福建厦门 361001）摘要目的 研究降钙素原（procalcitonin，PCT）是否通过增加肠黏膜磷酸化蛋白激酶 C（p-protein kinase C，p-PKC）表达，减少闭合蛋白表达，从而损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障。方法 120150g SPF级SD雄性大鼠20只，使用随机数表法随机分5组（每 组 4只）。正常组：不做
2、任何处理；脓毒症组：盲肠结扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）造模；脓毒症+PCT 组：大鼠 CLP 造模后，尾静脉注射 PCT；脓毒症+PCT+Go6983组：大鼠 CLP 造模后，先后经尾静脉注射 PCT 及 Go6983（PKC 磷酸化抑制剂）；脓毒症+Go6983 组：大 鼠 CLP 造模后，尾静脉注射 Go6983。术后 24h 于眼静脉取血 1ml行血清 D-乳 酸（D-lactic acid，D-lac）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）浓度测定，取血后处死大鼠，留取回肠末端肠道组织行组织学、免疫组化、免疫荧光、原位末端标
3、记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检查。结果 与正常组比较，脓毒症组大鼠血清 D-lac、DAO 水平水平明显升高（0.390.14）mmol/L 比（5.150.66）mmol/L，（12.173.34）U/L 比（31.433.94）U/L，P 均0.001；肠道组织中肠黏膜细胞p-PKC 表达增加（58.8511.43）103IOD 比（111.2514.96）103IOD，闭合蛋白表达量减少（317.4123.46）103IOD 比（192.9815.97）103IOD，肠黏膜细胞凋亡增加（15.930.87）103IOD 比（2
4、0.531.87）103IOD，P 均0.001，肠 道组织病理损伤加重。与脓毒症组比较，脓毒症+PCT 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平升高（5.150.66）mmol/L比（7.550.76）mmol/L，（31.433.94）U/L比（58.717.54）U/L，P 均 0.001，肠道组织中肠黏膜细胞 p-PKC 表达增加（111.2514.96）103IOD比（220.5124.04）103IOD，闭合蛋白表达量减少（192.9815.97）103IOD比（91.289.7）103IOD，肠黏膜细胞凋亡增加（20.531.87）103IOD 比（28.051.48）103IOD，
5、P 均 0.001，肠道组织病理损伤加重。与脓毒症+PCT 组相比，脓毒症+PCT+Go 6983 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平升高程度减少（7.550.76）mmol/L比（5.550.73）mmol/L，（58.717.54）U/L 比（42.682.78）U/L，P 均 0.001，肠道组织中肠黏膜细胞 p-PKC 表达减少（220.5124.04）103IOD比（157.1312.79）103IOD，P=0.002，闭合蛋白表达量增多（91.289.7）103IOD 比（131.2311.58）103IOD，P 0.001，肠黏膜细胞凋亡减少（28.051.48）103IOD
6、比（22.660.72）103IOD，P 0.001，肠道组织病理损伤减轻。与脓毒症+PCT+Go 6983 组相比，脓毒症+Go 6983 组大鼠血清 D-lac、DAO 水平下降（5.550.73）mmol/L 比（2.820.49）mmol/L，（42.682.78）U/L 比（23.283.86）U/L，P 0.001，肠道组织中肠黏膜细胞p-PKC表达减少（157.1312.79）103IOD 比（81.8411.53）103IOD，闭合蛋白表达量脓毒症基金项目：福建省卫生健康科技计划项目厦门市医疗卫生科技计划项目（3502Z20194019）通信作者：王隽笙，Email：2 创伤与
7、急诊电子杂志 2023年3 月 第11 卷 第1 期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.1增加（131.2311.58）103IOD 比（260.3711.44）103IOD，肠黏膜细胞凋亡减少（22.660.72）103IOD比（19.141.05）103IOD，P 均 0.001，肠道组织病理损伤减轻。结论 PCT 使脓毒症大鼠肠黏膜细胞 p-PKC 表达增加，闭合蛋白表达减少，加重脓毒症大鼠肠屏障功能损害。关键词降钙素原；脓毒症；肠道屏障功能；磷酸化蛋白激酶 C；闭合蛋白DOI：10.16746/ki.11-9332/r.2023.01.001Proc
8、alcitonin impairs intestinal mucosal barrier by decreasing occludin expression via activation of p-PKC in septic ratsLiu Huiheng,Wang Junsheng,Lin Jinzhou,Guo Mengyu,Hu Ting(Department of Emergency,Zhongshan Hospital,Xiamen University,Xiamen 361001,Fujian,China)Abstract Objective To investigate whet
9、her procalcitonin(PCT)damages the intestinal mucosal barrier in sepsis rats by increasing the expression of intestinal protein kinase C(p-PKC)and reducing the expression of occludin.Method Twenty male SD rats with SPF grade(120g150g)were divided into five groups with random number table method:inclu
10、ding normal group:no treatment;sepsis group:cecal ligation(CLP)model;sepsis+PCT group:PCT was injected into the caudal vein after CLP modeling;sepsis+PCT+Go 6983 group:PCT and Go 6983(p-PKC inhibitor)were injected into the tail vein after CLP modeling;and sepsis+Go 6983:Go 6983 was injected into the
11、 caudal vein after CLP modeling.Serum D-lactic acid(D-lac)and diamine oxidase(DAO)concentrations were measured at 1 ml of ophthalmic vein blood after 24 hours.The rats were killed after blood collection,and the distal ileum intestinal tissues were retained for histological,immunohistochemical,immuno
12、fluorescence and TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)examinations.Result Compared to the normal group,the sepsis group showed a significant increase in serum D-lac level(0.390.14)mmol/L vs(5.150.66)mmol/L,P0.001,serum DAO level(12.173.34)U/L vs(31.433.94)U/L,P0.001 and the expression of p-PKC(
13、58.8511.43)103 vs(111.2514.96)103,IOD,P0.001,and a decrease in the expression of occludin(317.4123.46)103 vs(192.9815.97)103,IOD,P0.001.Intestinal mucosal cell apoptosis also increased(15.930.87)103 vs(20.531.87)103,IOD,P0.001,along with an increase in intestinal tissue pathological injury.Compared
14、to the sepsis group,the sepsis+PCT group showed a significant increase in serum D-lac level(0.390.14)mmol/L vs(5.150.66)mmol/L,P0.001,serum DAO level(12.173.34)U/L vs(31.433.94)U/L,P0.001 and the expression of p-PKC(58.8511.43)103 vs(111.2514.96)103,IOD,P0.001,and a decrease in the expression of occ
15、ludin(317.4123.46)103 vs(192.9815.97)103,IOD,P0.001.Intestinal mucosal cell apoptosis also increased(15.930.87)103 vs(20.531.87)103,IOD,P0.001,along with an increase in intestinal tissue pathological injury.Compared to the sepsis+PCT group,the sepsis+PCT+Go 6983 group showed a decrease in the increa
16、se level of serum D-lac(7.550.76)mmol/L vs(5.550.73)mmol/L,P0.001,serum DAO level(58.717.54)U/L vs(42.682.78)U/L,P 0.001,and the expression of p-PKC(220.5124.04)103 vs(157.1312.79)103,IOD,P=0.002,and an increase in occludin expression(91.289.7)103 vs(131.2311.58)103,IOD,P0.001,a decrease in intestin
17、al mucosal cell apoptosis(28.051.48)103 vs(22.660.72)103,IOD,P0.001,and alleviated pathological damage of intestinal tissue.Compared to the sepsis+PCT+Go 6983 group,the sepsis+Go 6983 group showed a decrease in serum D-lac level(5.550.73)mmol/L vs(2.820.49)mmol/L,P 0.001,serum DAO level(42.682.78)U/
18、L vs(23.283.86)U/L,P0.001,and the expression of p-PKC(157.1312.79)103 vs(81.8411.53)103,3 创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.1IOD,P0.001,along with an increase in the expression of occludin(131.2311.58)103 vs(260.3711.44)103,IOD,P0.001,a decrease in intestinal mucosal cell
19、 apoptosis(22.660.72)103 vs(19.141.05)103,IOD,P 0.001,and alleviated pathological damage of intestinal tissue.Conclusion PCT was found to increase the expression of p-PKC while decreasing the expression of occludin in intestinal mucosal cells,which is associated with the exacerbation of intestinal b
20、arrier function injury in septic rats.Key words Procalcitonin;Sepsis;Intestinal barrier function;p-protein kinase C;Occludin降钙素原（Procalcitonin，PCT）作为临床广泛使用的炎症标志物，在脓毒症尤其是在泌尿系统、胆道系统、腹腔感染时明显升高1-3。既往的研究表明，相比于革兰氏阳性菌感染，在革兰氏阴性菌感染时PCT的升高更明显，革兰氏阴性菌可通过LPS-TLR4-NFB通路激活PCT的合成4。有研究表明，PCT有直接的细胞毒性可诱导细胞凋亡5-7。在脓毒症中往
21、往伴随肠黏膜屏障受损8，使肠菌位移，引起内毒素血症，这在一定程度上，可形成正反馈循环，使PCT在短时间内急剧升高，从而导致机体持续损害。紧密连接（tight junction，TJ）在肠黏膜屏障中起到重要作用，闭合蛋白是TJ的重要成分9-10，多种细胞外分子可通过调控蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的磷酸化而影响闭合蛋白的表达11-12，PCT的升高常常伴随肠黏膜屏障损害，脓毒症时炎症介质和内毒素相关的PCT升高可能诱导肠黏膜细胞凋亡增加和肠上皮TJ损害。因此，PCT可能成为脓毒症干预的新靶点。PCT的病理学作用尚未被完全阐明，本文通过建立脓毒症大鼠模型，研究PCT是否通
22、过影响磷酸化的PKC（p-PKC）、闭合蛋白表达损害脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能。1 材料与方法1.1 实 验 动 物及分 组 成年雄性清洁级SD大鼠（体重120150g）20只，所有实验大鼠均购自上海市斯莱克实验动物公司，饲养于厦门大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2017-0005。温度控制在25，光暗周期为12h，大鼠可自由获取食物和水。实验过程均严格遵守动物福利与伦理准则和指南的相关规定。以随机数表对每只大鼠行随机编号，以其号数除以5的余数作为分组依据，余数0编为正常组，余数1编为脓毒症组，依次类推。20只大鼠，随机分为5组，每组4只。正常组：不做任何处理；脓毒症组：盲肠
23、结扎穿孔法13-15（cecal ligation and puncture，CLP）造模；脓毒症+PCT组：大鼠行CLP术，术后通过尾静脉注射PCT（30mg/kg）16；脓毒症+PCT+Go 6983组：大鼠行CLP术，术后经尾静脉注射PCT（30mg/kg）及Go 6983PKC磷酸化抑制剂，10mmol/（Lkg）17；脓毒症+Go 6983组：大鼠行CLP术，术后经尾静脉注射Go 698310mmol/（Lkg）。本实验通过大鼠的行为、毛色、生化指标及各脏器功能评估造模是否成功，脓毒症造模一致性评价等具体见本课题组先前发表的论著4。1.2 主 要 仪 器和 试 剂 PCT购自中国近岸
24、蛋白公司（Catalog No.CF96）；Go 6983，购自美国Med Chem Express（Catalog HY-13689）；一抗闭合蛋白购自美国Affnity公司（Catalog DF7504）；一抗p-PKC购自美国Affnity公司（Catalog AF8396）；荧光二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）Fluor488-conjugated）购自美国Affnity公司（Catalog No.S0018）；Tunel试剂盒购自大连美伦生物有限公司。免疫组化相关试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司；D-乳酸（D-Lactic acid，D-lac）试剂盒、二胺
25、氧化酶（diamine oxidase，DAO）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，荧光显微镜AxioVertA1荧光显微镜购自德国ZEISS公司。1.3 标 本 收集 各组大鼠经处理后24h眼静脉取血1ml，3000转/min 3min分离出血清，80冻存，用于血清D-lac、DAO检测，而后过量麻醉法处死大鼠，留取回肠末端肠道组织置入4%甲醛固定。按病理学常规梯度脱水、透明、包埋制作蜡块。行组织学、免疫组化、原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）检查。1.4 实验方法 1.4.1 ELISA法测定脓毒症大鼠血DAO、D-lac的
26、浓度 按试剂盒说明书操作测量。大鼠血浆，3000转/min，3min，离心取上清，设空白孔、标准孔和待测样品孔，顺次加入检测溶液A、检测工作液B 100l、底物溶液，反应相应时间，最后加终止溶液终止反应，450nm波长，依序测量各孔的光密度（optical density，OD）值。同时用标准蛋白作一标准曲线，分别计算DAO、D-lac浓度。1.4.2 苏木精-伊红染色染色、免疫组化、免疫荧光、TUNEL检测（1）苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）。将标本蜡块切片，厚度6m，4 创伤与急诊电子杂志 2023年3 月 第11 卷 第1 期
27、J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.160烤片，顺序脱蜡水化，以苏木精染色液，染色1min，流水冲洗返蓝，伊红染色1min，烘干后，封片，显微镜下观察，拍照，对比小肠黏膜镜下病理改变。采用Chius分级18行小肠黏膜损伤评级：0级为正常小肠黏膜绒毛；1级为在绒毛中轴出现肠黏膜上皮下的Gruenhagens间隙，常伴随毛细血管充血；2级为来自固有膜的肠黏膜上皮抬高及肠上皮下间隙扩张；3级为大片肠黏膜上皮抬高，绒毛向两侧倒伏，部分绒毛顶端脱落；4级为绒毛及固有膜脱落，裸露的毛细血管扩张，可观察到固有膜细胞成分构成增加；5级为固有膜蜕变或被消化，出血或溃疡形成。由3
28、名不同的病理医师阅片评级，取平均值作为每例切片的评级。（2）免疫组化。切片常规脱蜡水化步骤如HE染色，TE修复液（10mmol/L三羟甲基氨基甲烷+1mmol/L乙二胺四乙酸，无需调整pH）高压修复5min，3%过氧化氢封闭3min，牛血清封闭3min，一抗孵育4过夜，一抗p-PKC以孵育液4孵育过夜（孵育液：TBST缓冲液+3%脱脂牛奶，稀释度1500）。37复温30min，迈新通用型免疫组化试剂二抗孵育30min，迈新通用型免疫组化试剂二抗孵育30min，以上两步之间均以PBS缓冲液冲洗3遍，每遍1min，新制DAB显色3min，苏木精复染，流水冲洗，95%乙醇脱水3min，烘干、封片，普
29、通光镜下观察小肠黏膜镜下病理改变，拍照。（3）免疫荧光。切片常规脱蜡水化步骤、TE修复、过氧化氢封闭、牛血清封闭具体步骤同上，一抗孵育4过夜，孵育条件：一抗闭合蛋白以孵育液4孵育过夜，（孵育液：TBST缓冲液+3%脱脂牛奶，稀释度1500）。37复温30min，荧光二抗37孵育60minGoat Anti-Rabbit IgG（H+L）Fluor488-conjugated 1500，以PBS缓冲液稀释，DAPI染液复染1min，以上两步之间均以PBS缓冲液冲洗3遍，每遍1min，荧光镜下观察小肠黏膜镜下病理改变，拍照。（4）TUNEL。切片常规脱蜡水化步骤同上，蛋白酶K消化（20g/ml），
30、室温作用10min，PBS缓冲液冲洗3遍，以TdT酶加入荧光标记液配制成TUNEL检测液。在样品滴加适量 TUNEL检测液，37孵育60min，注意避光。PBS缓冲液冲洗3遍，用甘油封片液封片后荧光显微镜下观察。1.5 统计 学分析 采用SPSS20.0软件对数据进行统计分析。计量资料使用Shapiro-Wilk法（W检验）进行正态性检验。对各组符合正态分布且方差齐的计量资料采用均数标准差即xs描述，多组间比较采用方差分析，使用LSD-t法进行两两比较，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 PCT 对 脓 毒 症 大 鼠 肠屏 障 损 害血清 标 志物 的影响 与正常组比较，脓毒症组血
31、清D-lac、DAO水平明显升高（tD-lac=11.205，P0.001，tDAO=5.910，P0.001）；与脓毒症组比较，脓毒症+PCT组血清D-lac、DAO水平进一步升高（tD-lac=5.653，P0.001，tDAO=8.376，P0.001）；对比脓毒症+PCT组，脓毒症+PCT+Go 6983组血清D-lac、DAO水平下降（tD-lac=4.711，P0.001，tDAO=4.922，P0.001）；对比脓毒症+PCT+Go 6983组，脓毒症+Go 6983组血清D-lac、DAO水平下降（tD-lac=6.442，P0.001，tDAO=5.955，P0.001）。脓
32、毒症大鼠注射PCT后，对比单纯脓毒症大鼠，其肠屏障损害血清标志物水平升高，若在脓毒症+PCT的基础上注射p-PKC抑制剂Go 6983后，大鼠肠屏障损害血清标志物水平有所下降（表1）。2.2 PCT对 脓 毒 症 大 鼠 肠 道病 理损 害、肠 黏膜 细胞p-PKC、闭合蛋白表 达 的 影 响 与正常组比较，脓毒症组大鼠肠道病理损害重，呈黏膜肿胀、坏死、细胞脱落、黏膜下层炎细胞浸润，肠黏膜细胞p-PKC增加（t=4.726，P0.001），闭合蛋白表达减少（t=11.532，P0.001）；与脓毒症组比较，脓毒症+PCT组上述肠道病理损害进一步加重，出现黏膜坏死，肠黏膜p-PKC进一步增加（t
33、=9.854，P0.001），闭合蛋白表达进一步减少（t=3.703，P0.001）；对比脓毒症+PCT组，脓毒症+PCT+Go 6983组大鼠肠道上述病理损害减轻，肠黏膜细胞p-PKC表达减少（t=5.717，P0.001），闭合蛋白表达增加（t=9.854，P=0.002）；对比脓毒症+PCT+Go 6983组，脓毒症+Go 6983组大鼠肠道上述病理损害减轻，肠黏膜细胞p-PKC表达减少（t=6.791，P0.001），闭合蛋白表达增加（t=11.970，P=0.002）。脓毒症大鼠注射PCT后，对比单纯脓毒症大鼠，其肠屏障损害加重、p-PKC表达增加、闭合蛋白表达减少，若在脓毒症+PC
34、T的基础上注射p-PKC 抑制剂Go 6983后，肠屏障损害减轻、p-PKC表达减少、闭合蛋白表达增加（图1、表2）。5 创伤与急诊电子杂志 2023年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.1表1 各组大鼠血清肠黏膜损伤标志物D-lac、DAO水平统计表（xs）组别 只数 D-lac（mmol/L）DAO（U/L）正常组 4 0.390.14 12.173.34脓毒症组 4 5.150.66$31.433.94$脓毒症+PCT组 4 7.550.76*58.717.54*脓毒症+PCT+Go 6983组 4 5.550.73#42.682
35、.78#脓毒症+Go6983组 4 2.820.41&23.283.78&F值 84.01 60.47P值 0.001 0.001注：D-lac为D-乳酸；DAO为二胺氧化酶；Go6983为蛋白激酶C磷酸化抑制剂；$表示与正常组相比，P0.001，*表示与脓毒症组相比，P0.001；#表示与脓毒症+PCT组相比，P0.001；&表示与脓毒症+PCT+Go6983组相比，P0.001。图1 各组大鼠肠黏膜病理损害、p-PKC、闭合蛋白表达情况正常组 脓毒症组 脓毒症+PCT组 脓毒症+PCT+Go 6983组 脓毒症+Go 6983组HE染色p-PKC免疫组化DAPI染色闭合蛋白免疫荧光Merg
36、eHE染色为苏木精-伊红染色；DAPI为4，6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，DAPI染色后细胞核呈蓝色荧光；p-PKC为磷酸化的蛋白激酶C；Go6983为p-PKC抑制剂；Merge表示肠道组织DAPI染色与免疫荧光染色的合成图；表示上皮细胞坏死、黏膜破坏；表示p-PKC免疫组化阳性染色，呈细胞浆中深棕色染色；表示闭合蛋白免疫荧光阳性染色，呈高亮绿色荧光，沿细胞边缘呈渔网状分布。6 创伤与急诊电子杂志 2023年3 月 第11 卷 第1 期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.12.3 PCT对脓毒症大鼠肠道细胞凋亡的影响 以T
37、UNEL法测定脓毒症大鼠肠黏膜细胞凋亡情况，阳性染色为高亮绿色，与正常组比较，脓毒症组大鼠肠黏膜TUNEL阳性染色增加，细胞凋亡增加（t=5.099，P0.001）；与脓毒症组比较，脓毒症+PCT组TUNEL阳性染色进一步增加，细胞凋亡进一步增加（t=8.346，P0.001）；对比脓毒症+PCT组，脓毒症+PCT+Go 6983组TUNEL阳性染色减少，细胞凋亡减少（t=5.983，P0.001）；与脓毒症+PCT+Go 6983组比较，脓毒症+Go 6983组TUNEL阳性染色减少，细胞凋亡减少（t=3.904，P0.001）。脓毒症大鼠注射PCT后，对比单纯脓毒症大鼠，其肠黏膜细胞凋亡加
38、重；若在脓毒症+PCT的基础上注射PKC抑制剂剂Go 6983后，肠黏膜细胞凋亡减轻（图2）。表2 各组大鼠肠黏膜p-PKC、闭合蛋白表达量（xs）组别 只数p-PKC表达量（103IOD）闭合蛋白表达量（103IOD）正常组 4 58.8511.43 317.4123.46脓毒症组 4 111.2514.96$192.9815.97$脓毒症+PCT组 4 220.5124.04*91.289.7*脓毒症+PCT+Go 6983组 4 157.1312.79a131.2311.58b脓毒症+Go 6983组 4 81.8311.53&260.3711.44&F值 67.427 61.201P值
39、 0.001 0.001注：p-PKC为磷酸化蛋白激酶C；IOD为累积光密度；Go6983：p-PKC抑制剂；$表示与正常组相比，P0.001，*表示与脓毒症组相比，P0.001；a表示与脓毒症+PCT组相比，P=0.002；b表示与脓毒症+PCT组相比，P0.001；&表示与脓毒症+PCT+Go6983组相比，P0.001。图2 各组大鼠肠黏膜TUNEL染色A.正常组；B.脓毒症组；C.脓毒症+PCT组；D.脓毒症+PCT+Go 6983组；E.脓毒症+Go 6983组；F.各组大鼠肠黏膜TUNEL阳性染色统计图；TUNEL为原位末端标记法，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记；I
40、OD为累积光密度；p-PKC为磷酸化的蛋白激酶C；Go 6983为p-PKC抑制剂；表示TUNEL阳性染色，呈细胞核内高亮绿色，提示DNA断裂，细胞凋亡；$表示与正常组相比，P0.001，*表示与脓毒症组相比，P0.001；#表示与脓毒症+PCT组相比，P0.001；&表示与脓毒症+PCT+Go 6983组相比，P0.001。A B CDE FTUNEL阳性染色量正常组脓毒症组脓毒症+PCT组脓毒症+PCT+Go 6983组脓毒症+Go 6983组100203040103IOD15.930.8720.531.8728.051.4822.660.7219.141.057 创伤与急诊电子杂志 20
41、23年3月 第11卷 第1期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.13 讨论PCT是临床常用的感染指标，是降钙素的前体蛋白，正常状态下由甲状旁腺细胞合成，血清水平很低。在感染状态下，PCT的表达量急剧升高，血清PCT水平显著升高19。尽管PCT常常作为相对特异的细菌感染标志物，但是不同细菌感染引起的PCT升高的程度不同。相比于真菌、革兰氏阳性菌，革兰氏阴性菌感染引起的PCT水平升高更明显20，一些研究认为革兰氏阴性菌细胞壁产生的内毒素可刺激机体合成PCT，而革兰氏阴性菌破裂后，其所含有的内毒素释放入血，形成内毒素血症21。因此在临床的应用中，常常可以观察到泌尿
42、系统、腹腔、胆道感染中，患者的血清PCT明显升高，其中，以腹腔感染PCT升高最明显，这与赵志鹏等22的研究结果一致。肝脏是产生PCT的主要器官之一，肝PCT的表达主要来源于肝巨噬细胞，而非肝细胞本身，在肝切除的内毒素血症中并不会出现PCT的明显升高。在机体内，肠道拥有最大的菌库，其菌群构成以革兰氏阴性菌、厌氧菌为主，而由于肝门静脉结构的存在，肠道血运大部分由门静脉引流回收，若出现肠道感染或肠屏障受损，极易引起内源性内毒素血症，导致PCT显著升高。而在胆道、泌尿系的感染中，革兰氏阴性菌造成的感染比例高，易引起脓毒症，常常伴随肠屏障受损。上述原因是造成泌尿系、胆道、腹腔感染后血清PCT显著升高的重
43、要原因。因此肠屏障功能受损在机体感染后血清PCT升高中扮演重要的角色。同时，研究表明，PCT有直接细胞毒性作用并可诱导细胞凋亡5-7。综上，脓毒症时炎症介质和内毒素相关的PCT升高可能诱导肠上皮细胞凋亡增加，损害肠黏膜屏障功能，加重内源性内毒素血症及细菌移位，导致血清PCT急剧升高，但目前PCT具体的病理生理作用及其分子机制并未被彻底阐明。肠黏膜屏障由细胞、分子、间质等多种复杂成分构成，其中细胞间连接是维持肠黏膜屏障正常功能的重要结构，它包括肠上皮细胞间的连接，包括TJ、缝隙连接（gapjunction，GJ）、黏着连接（adhesion junction，AJ）及桥粒等，在这些结构中，TJ在
44、维持肠屏障正常功能中发挥着重要作用，闭合蛋白是紧密连接的重要组成部分，它能与Claudin-1、Claudin-2及ZO等紧密连接相关蛋白结合，形成紧密连接复合体，闭合蛋白对维持TJ的结构和功能起到重要作用23-24。闭合蛋白的合成、转位、组装受到多种细胞信号的调控，Tang等25研究了Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）-PKC-闭合蛋白通路在血脑屏障中的作用，在该研究中，建立了脑微血管内皮细胞模型，以TLR4抑制剂（TAK-242）、小干扰RNA分别阻断TLR4、PKC的信号转导，结果发现阻断TLR4后可引起PKC表达下降，引起闭合蛋白表达增加，故TLR4
45、-PKC-闭合蛋白信号通路与血脑屏障损伤密切相关。这说明闭合蛋白的表达受PKC的调控。而PKC由不同的同工酶组成。PKC参与了众多正常细胞和异常细胞的增殖、分化、凋亡等多种生命活动，是细胞中重要的信号转导分子。PKC是经典PKC亚型，它的激活需要钙离子和二酰甘油二酯（diacylglycerol，DAG），DAG的浓度增加往往是由于细胞外信号激活了膜受体，继而激活磷脂酶C，分解磷脂酰肌醇3，在这个过程同时产生1，4，5，三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3），它可与其受体结合，激活胞内钙库，释放钙离子26。PCT作为降钙素基因相关肽家族的一员，与降钙素原相关肽（Cal
46、citoningene relatedprotein，CGRP）具有同源性。PCT具有50%60%的CGRP受体激动剂活性27，因此PCT可能通过激活CGRP受体而发挥其病理生理功能。CGRP受体又称CRLR，是经典的G蛋白偶联跨膜受体，其激活后可激活磷脂酶C，分解磷脂酰肌醇3，引起DAG与IP3升高，磷酸化PKC。因此，PCT可激活CRLR，进而磷酸化PKC，影响闭合蛋白表达，最终影响肠黏膜屏障功能。本研究建立了CLP脓毒症模型，脓毒症大鼠肠屏障损害血清标志物D-lac、DAO水平升高，说明脓毒症大鼠的肠黏膜屏障功能受损。HE染色病理检查显示小肠黏膜肿胀、坏死、细胞脱落、黏膜下层炎细胞浸润等
47、，这提示肠屏障结构改变。免疫组化、免疫荧光检测发现肠黏膜p-PKC表达增加，紧密连接分子闭合蛋白表达减少，TUNEL检测提示肠黏膜细胞凋亡增加，说明在脓毒症时，细菌通过激活肠黏膜细胞p-PKC表达，引起闭合蛋白表达减少，导致黏膜细胞凋亡增加。在脓毒症的基础上，若给予PCT注射，相比于脓毒症组，脓毒症+PCT组大鼠肠道病理损害进一步加重，肠黏膜损害标志物进一步升高，肠黏膜p-PKC表达进一步增加，紧密连接分子闭合蛋白表达进一步减少，TUNEL检测提示肠黏膜细胞凋亡增加。这提示PCT可通过增加肠黏膜p-PKC表达，下调闭合蛋白表达，引起肠黏膜屏障结构及功能损害。在上述基础上加入PKC磷酸化抑制剂G
48、o 6983，以抑制该信号通路的转导，即脓毒症+PCT+Go 6983组，重复上述检测，PCT引起的损害情况得到减轻。这进一步证明上述分子信号通路的激活过程。本课题有一定研究局限性，首先，课题组缺乏精确的大鼠生命监测仪，课题组通过大鼠的行为、毛色、生化指标及各脏器功能评估造模是否成功，虽然8 创伤与急诊电子杂志 2023年3 月 第11 卷 第1 期 J TRAUMA EMERG，Mar.2023，V ol.11，No.1在长期的实验中获得了相对稳定的评价体系，但疾病严重程度仍需要体温、细胞因子等参数的评价。其次，考虑到PCT升高的前提是机体存在感染，因此实验设计始终以脓毒症为前提，未考虑PC
49、T对健康大鼠的直接作用；需要进一步完善细胞实验验证PCT的直接致病作用及机制。最后，本研究中只涉及PKC的一种亚型，而了解PKC不同亚型在PCT病理生理机制中的作用亦对全面了解PCT的机制有积极意义。总之，尽管PCT是目前广泛应用的感染指标，但其具体的病理生理作用仍未完全阐明。本研究发现了PCT会对肠黏膜屏障造成损害，并影响其部分信号转导机制，若对其信号转导进行抑制，则有可能减轻PCT对黏膜屏障的损害。这为脓毒症临床治疗提供了新的思路。参考文献1 王轶伟,郭仁德,宋冰,等.血清PCT对复杂腹腔感染患者抗菌药物治疗的指导价值J.中华医院感染学杂志,2018,28(15):2337-2340.2
50、胡少军,李超,周中泉,等.泌尿外科下尿路结石患者感染状况及血清PCT水平分析J.中华医院感染学杂志,2018,28(7):1045-1048.3 徐涛,金法,李宁,等.血清CRP、IL-6及PCT对胆道感染的诊断价值J.中华医院感染学杂志,2017,27(2):377-380.4 LIU HH,WANG JS,LIN JZ,et al.LPS induced PCT production via TLR-4/NF-B passway:it is the dierence of G-/G+bacteremia ratsJ.Cytokine,2021,137:155317.5 SAUER M,DO
