1、从印度进口的洋葱中检出洋葱黄矮病毒2007 年第 4 期植物检疫 M.ANTQUARANTINEVo1.21No.4株 2 不属于 Acidovorax 属 .利用 ITS 通用引物对菌株 1 扩增获得 850bp 的条带,将 PCR 产物中的目的片段回收纯化后进行测序(宝生物工程(大连)有限公司).利用 NCBIBlast 将所测序列与已发表序列进行比对和同源性分析.发现与兰花褐斑病菌 FC一502(编号 DQ360417.1)菌株同源性为 100%.由上述结果可进一步确定菌株 1 为兰花褐斑病.图 2 特异性 PCR 反应琼脂糖凝胶电泳照片3 结论兰花褐斑病菌(Acidovoraxave?
2、l,osubsp.cattleyae)为假单胞菌科中嗜酸菌属(Acidovora),本属中危害植物的仅有 Acidovoraxave?l,o和Acidovoraxkonjaci(魔芋细菌性叶斑病菌)两个种.Acidovoraxavertae 包括 3 个亚种,其中为害兰花的仅为兰花褐斑病菌,寄主类别的单一性为鉴别提供了有利条件.本实验中从危害症状,致病性,生化反应等方面均证明分离到的菌株 1 为兰花细菌性褐斑病.而 PCR 及 DNA 序列同源性分析结果进一步证明结果的可靠性.在 PCR 模板制备中我们还采用了另外两种方法:一种为直接蘸取培养的菌落(小米粒大小)作为模板;另一种为用 75%酒精
3、消毒病斑后,滴一滴无菌蒸馏水,用灭菌小刀轻刮病斑后取 1015 作为模板,均取得好的效果.DNA同源性分析有准确可靠的优点,但同时也存在检测及测序时间相对较长,费用相对较高等缺点,进一步改进检测方法将有利于进出口兰花检验检疫工作.参考文献1.王春林,等.潜在的植物检疫性有害生物图鉴.中国农业出版社,2005.264266.2.方中达.植病研究法.中国农业出版社,1997.156211.3.陆家云.植物病害诊断(第二版).中国农业出版社,1995:228263.4.WalcottRR,C,itaifisRD.Dt 舾 ctimofAcidovoraxaf;ell,aesLd】即.citrulli
4、inwatefflseedusiIlginmmnomagneticBepailandthepolymerasechainnd.PlantDisease,2OOO,84(4):470 474.从印度进口的洋葱中检出洋葱黄矮病毒郑耘陈枝楠杨伟东吴绍精(深圳出入境检验检疫局 5moo1)DetectingofOn/onyellowawarfv/rusintheonionimportedfromIndia.朗gYun,ChenZhinan,YangWeidong,WuShaojing(ShenzhenExitEntryInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen,518
5、001)AbstractInthispapertheonionbulbsimportedfromIndiawereplantedinquarantinegreenhouse.11lml1gIlsymptomobservation,oneonionseedlingwithdwarfsymptomappearedyeUowstrip,crimplesymptomsonleaves.ByDASELISA,RTPCRdetectionandsequenceanalysis,itWaSconfirmedthatOnionyellowdwa矿 virusWaSdetectedinoniontrimport
6、edfromIndia.KeywordsOn/onye/owdwarfv/rus,RTPCR,DASELISA摘要本文报道了从印度进口的洋葱中检出洋葱黄矮病毒.从印度进口的洋葱种球经过隔离试种,有1 株洋葱幼苗发生整株矮化,叶片出现无规则的黄色条纹,皱缩等症状,经 DAS-ELISA,RTPCR 检测和序收稿日期:2OO701232122007 年第 4 期植物检疫 PLANTQUARANTINEVo1.21No.4列分析验证,确认该批从印度进口的洋葱鳞球茎中携带有洋葱黄矮病毒(Onionyellowdwarfvirus).关键词洋葱黄矮病毒 RTPCRDASELISA中图分类号 S4130,
7、$432.434洋葱黄矮病毒(Onionyellowdwa 矿 vitus,OYDV)属于马铃薯 Y 病毒科 (Potyviridae)马铃薯Y 病毒属(Potirus), 病毒形态为弯曲线状 ,无包膜,长约 68090011111,直径约 1113nm,螺旋对称结构,核酸分子为单股正链 RNA,大小约 9.7kb.OYDV 的寄主为洋葱,大蒜,该病毒远距离通过鳞茎传播,在田间依靠蚜虫传播.受 OYDV 侵染的洋葱产生黄矮症状.洋葱植株产生矮化,叶片出现无规则的黄色条纹直至叶片几乎完全黄化,并产生叶片下卷,扁平,皱缩和脆化等症状.亦可在出芽和储存期间出现洋葱鳞球茎的腐败变质症状.带有 OYDV
8、 的洋葱种子产生花茎条纹,皱缩和变形,并引起花与种子数目的减少及种子品质的降低.OYDV 在绝大部分种植洋葱和葱的国家和地区均有分布.如欧洲的捷克斯洛伐克,丹麦,法国等;美洲的阿根廷,巴西,智利,加拿大,美国等;亚洲的印度(德里 ),伊拉克 ,日本等;大洋洲的澳大利亚.我国的黑龙江省也有分布的报道2】.国内外在洋葱生产中普遍采用 DASELISA 方法和分子生物学方法检测 OYDV.由于 DASELISA 方法具有操作简便,准确性高,稳定性好等优点,许多国家和国际组织已将 DAS-ELISA 方法列为标准方法检测 OYDV.Kobayashi 等根据 OYDV 衣壳蛋白基因的序列,设计特异性引
9、物,建立特异,灵敏的 R11_PCR 方法检测 OYDV.Miyuki 等应用上述检测方法对日本北部大蒜上出现的 OYDV 进行了鉴定,证明该检测方法准确可靠,可以将同时侵染大蒜的大蒜潜隐病毒(Garliclatentvirus,GLV),大蒜花叶病毒(Garlicnmsaicvirus,GMV),韭葱黄条病毒(Leekyellowstripevirus,LYsv),螨虫传花叶病毒(Mite-bornemosaicvirus),4 种病毒严格区分 H.本文采用症状观察,DAS-ELISA 方法,RTPCR 及序列分析方法,从印度进口的洋葱种球中检出洋葱黄矮病毒,现将结果报道如下.1.材料与方法
10、1.1 检测样品深圳口岸进口印度洋葱鳞球茎送检样品.本实验室保存的无病毒健康洋葱幼苗作为阴性对照.1.2 症状观察将洋葱鳞球茎(20 粒) 隔离种植在 25的温室中,所用栽培土壤使用前经高温灭菌处理.洋葱鳞球茎萌发出叶片后观察症状.1.3DASELISA 检测隔离种植 20d 左右,摘取 20 株洋葱幼苗的叶片,每株取 100mg,加入 lmL 样品抽提缓冲液研磨,700g 离心 lOmin,取上清液,即为病毒粗提取液.DASELISA 检测按常规方法进行.DAS-ELISA检测试剂盒购自 ADI 公司.1.4RTPCR 检测1.4.1 洋葱叶片总 RNA 抽提摘取 DAS-ELISA 检测为
11、阳性的洋葱叶片及健康(阴性对照 )叶片各 100rag,用 RNA 抽提试剂盒抽提总 RNA,做为 RTPCR 反应的模板.RNA 抽提试剂盒购自上海生工生物工程公司.1.4.2 检测方法参照 Kobayashi 等方法进行 ,包括引物设计和PCR 反应程序,其中引物序列为:OL25 一 GATAAG.GATGTGGATGCAGG 一 3 和 ORl5一 CGATrAGCTGCCCTCTAAC3,【圳.RTPCR 反应所需试剂购自大连宝生物公司,检测引物也由该公司合成.1.5 测序验证RTPCR 扩增产物测序在 ABI3100 基因测序仪上完成,将测序结果与 GenBank 公布的基因序列进行
12、对比.2.结果2.1 症状在隔离种植的洋葱中,观察到 1 株幼苗矮化,叶片上出现无规则的黄色条纹症状.2.2DASELISA 检测结果选取 20 株洋葱幼苗,采用 DASELISA 方法检测洋葱黄矮病毒,结果表明幼叶出现黄色条纹等症状的洋葱幼苗检测结果呈阳性,0D 掰为 0.85,阴性对照 0D 蜘为 0.06,两者之比为 14 倍,远大于 2 倍的域值,说明这株洋葱幼苗样品中携带洋葱黄矮病毒.2.3RTPCR 扩增结果取 RTPCR 扩增产物,经 0.8%琼脂糖凝胶电泳,结果显示(图 1),从表现症状的洋葱叶片中特异性扩增到分子量为 601bp 左右的条带,与预期结果一2132007 年第
13、4 期植物检疫 PIANTQUARANTINEVo1.21No.4一致,而阴性对照(健康的洋葱植株),空白对照样品未能扩增得到特异性条带,说明表现症状的送检洋葱样品中含有洋葱黄矮病毒.750bp500bp图 1 洋葱黄矮病毒 RTPCR 检测结果1.DI2000DNAMarker;23.均为表现症状的洋葱叶片(2 次重复检测);4.健康洋葱叶片(阴性对照);5.空白对照;68.不表现症状的洋葱叶片样品2.4 测序验证RTPCR 扩增产物序列与 Genbank 上登录的OYDV 序列一致.将 RT-PCR 扩增产物的 DNA 片断测序,序列长度为 601bp,将该序列与 GenbBank上已登录
14、的基因序列进行 Blast 比较,发现其与已登录的多个 OYDV 衣壳蛋白基因和 RNA 聚合酶基因序列一致(AB000843,AB000845,AB000839,ABO00841,AJ409311 等),证明印度进口洋葱鳞球茎中含有 OYDV.3 讨论洋葱上常见的主要有 3 种病毒.洋葱黄矮病毒,韭葱黄条病毒,鸢尾黄斑病毒(hisyellowspotvirus)均可以侵染洋葱,其中,OYDV 和 LYSV 经常以复合侵染方式侵染洋葱.DASELISA 方法是植物病毒检测使用最广泛的方法,但存在着假阳性或假阴性现象.由于 DASELISA 方法是以病毒的衣壳蛋白作为检测目标,衣壳蛋白的遗传信息
15、量只占整个病毒遗传信息总量的 5%一 10%,因而,在检测中可能无法区分衣壳蛋白同源性较高的病毒,存在检测结果不准确的可能性o本试验在 DASELISA 检测阳性的基础上又对洋葱叶片进行了 RTPCR 检测及扩增产物测序验证试验,以避免假阳性结果的出现,增强试验的准确性,可靠性.侵染洋葱的 3 种病毒的基因组序列差别较大,选定差异较大的基因区段,设计特异性引物,可以-214-将各病毒严格区分.OYDV 和 LYSV 属于马铃蕃 Y病毒属;鸢尾黄斑病毒则还未归属.Gurts 等建立了特异性的 RTPCR 方法检测澳大利亚 4 个州种植的洋葱,葱叶片及种子中的鸢尾黄斑病毒,取得了较好的效果 L5.
16、而对于同属马铃薯 Y 病毒属的OYDV 和 LYSV,其基因组的同源率较高,必须通过比较,选择基因组上差异较大的部分设计引物,才能将两种病毒区别开来.根据 Shukla 和 WIlId 对马铃薯 Y 病毒属的研究,该属中病毒衣壳蛋白基因上的差异是区别不同病毒种的重要依据 L6.TMamitsu 等也发现 0YDV 和 LYSV 在 RNA 聚合酶基因,衣壳蛋白基因及 3非编码区基因的交界区段差别较大,可以此区别 OYDV 和 LYsVL8.一 ashi 等选择上述区段设计引物,建立了 OYDV 检测方法 J.Miyki 等应用该检测方法对日本北部大蒜上出现的 OYDV 进行了鉴定,取得了准确,
17、可靠的检测结果 J.本试验采用了 Kobayashi 等建立的 OYDVliTPCR 方法检测了由印度进口的洋葱鳞球茎样品,并对 RTPCR 产物进行了测序 ,结果表明印度进口的洋葱鳞球茎中携带有 OYDV,与 DASELISA和症状观察结果一致,证明本试验检测结果有效.参考文献1 董柿.葱蒜类病毒的分子生物学鉴定研究进展.微生物学免疫学进展.21105,33(4):7678.2 徐启江,丁国华,陈典.黑龙江省分蘖洋葱病毒病原的初步鉴定.西北农林科技大学(自然科学版),2003,31(2):5558.3KmyasIliK,llinomezP,BravoAlnnaeid,eta1.Coatpro
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