1、不同光动力剂量对 C6 胶质瘤细胞胞内游离钙的影响中国激光医学杂志 2003 年 5 月第 12 卷第 2 期ChinJLaserMedSurg,May2003,Vol12,No.2?论着?不同光动力剂量对 C6 胶质瘤细胞胞内游离钙的影响胡韶山杨宝峰岳武摘要目的研究不同剂量光动力作用后 c6 胶质瘤细胞内游离钙Ca 】i 的变化,探讨钙超载在光动力诱导 c6 胶质瘤细胞坏死和凋亡过程中的作用.方法常规培养 c6 胶质瘤细胞 ,以不同光动力剂量处理对数生长期的实验组细胞后,应用 Fluo 一 3/AM 为细胞内钙离子荧光指示剂,激光共聚焦显微镜测定各组 c6 胶质瘤细胞内游离钙的变化;MIT
2、法检测各组细胞的死亡率.结果光动力作用后 c6 胶质瘤细胞内游离钙明显升高,平均胞内钙离子浓度和细胞死亡率随着光动力剂量增加而增大.结论光动力作用后 c6 细胞钙超载在光动力诱导肿瘤细胞坏死和凋亡过程中起重要作用.关键词光动力治疗法;c6 胶质瘤细胞;钙超载;F1uo 一 3/AM中图分类号:R318.51;R730.264 文献标识码:A 文章编号:10039430(2003)02007604EffectofPhotodynamicTherapywithDifferentDosesonFreeCa2inC6GliomaCellHUShao?shan,YANGBao?feng,YUEWu.J.
3、DepartmentofNeurosurgery,theSecondAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin,150086,China2.PharmacologicCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin.3.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,HarbinABSTRACTObjectiveToinvestigatethechangeinCaiinC6gliomacellafterPDT
4、withIdifferentdosesanddiscusstheimportantroleofcalciumoverloadinPDTinducedC6gliomacellnecrosisandapoptosis.MethodsTheC6gliomascensweregrowninRPMI1640mediumsupplementedwith10%fe,talcalfseiMm,thentheceHswereharvestedduringthelogphaseofgrowthandtreatedbyhematoporphyrinmonomethylether(HMME)一 mediatedpho
5、todynamictherapywithdifferentdoses,respectively.Thechangein【CaiinC6gliomacellfollowingPDTwasdetectedbymeansofaconfocallaserscanningmicroscopeusingtheCa“indicatorFluo 一3/AM.ThemortalityofC6gliomacellunderdifferentoutputandtimeoflaserweremeasuredbymeansofMTI“reductionassay.ResultsThemortalityofC6cella
6、ndtheconcentrationoffreeCaincreasedwiththeincreaseinlightdosageduringtheearlystageofPDT,correlatedwithenergydensityoftheirradiation.ConclusionsThecalciumoverloadmayplayanimportantroleinPDTinducedcelldeathresponseprocesses.KeywordsPhotodynamictherapy;C6gliomacell;Calciumoverload;Fluo 一 3/AM光动力作用诱导肿瘤细
7、胞坏死和凋亡的学说众多,但根本机制尚未阐明.不同致伤因子引发细胞毒性反应中,细胞内钙超载被认为是众多病理过程的重要环节.了解细胞毒性反应过程中细胞内游基金项目:国家自然科学基金资助项目(30200086)作者单位:1.哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科 (哈尔滨市,150086)2.药理学院 3.第-ITS 床医学院神经外科作者简介:胡韶山(1970),男,黑龙江双城市人,医学博士,主要研究方向:脑垂体瘤的微创疗法和脑胶质瘤的光动力治疗.?76?中国激光医学杂志 2003 年 5 月第 12 卷第 2 期ChinJLaserMedSurg,May2003,Vol12,No.2离钙的变化对探讨光
8、动力作用的机制有重要意义.本实验着重研究不同光动力剂量作用后细胞内游离钙(Ca2i)和细胞死亡率的变化,为阐明光动力作用机制提供可参考的实验依据.材料与方法一,材料1.C6 胶质瘤细胞系,购于中国医学科学院上海细胞库.2.主要仪器 Ix 一 7O 型相差倒置显微镜(Olympus,El 本);LH400 型激光光动力治疗仪 (天津);微量加样器(Eppendorf,德国);InsightpluslQ型激光共聚焦显微镜(Meridan,美国),酶标仪(MR700 型,Dynatech,美国).3.主要试剂 HMME(第二军医大学).Fluo 一3/AM(BioRad),MIT(Sigma),DM
9、SO(Sigma).二,方法1.C6 胶质瘤细胞培养及实验分组将 c6 胶质瘤细胞接种于含 10%胎牛血清的 RPMI 一 1640 完全培养液 25ml 培养瓶中,将培养瓶放人 37,5%CO和 95%空气的培养箱中常规培养,待细胞处于对数生长期时,接种于 96 孔培养板,每孔加培养液 0.2ml,细胞浓度为 510/ml,加入光敏剂一血卟啉单甲醚 0.O1mg/ml,按实验分组要求培养.实验分组:对照组,光动力组.光动力组按光动力剂量 4O,8O,120,160,200,240 和 280J/cm 进一步分组.2.光动力处理将光动力组细胞常规培养 2h后,按实验要求对实验孔进行光动力照射,
10、分别给予不同光动力剂量:4O,80,120,160,200,240 和 280J/cmo3.细胞内cai 的测定将对照组及光动力处理后 1h 的 c6 胶质瘤细胞 ,经磷酸缓冲液(PBS)冲洗 3 次后,于 37条件下用 Fluo 一 3/AM(终浓度IOM)负载 45min.用移液管移人特制小槽上,用 InsightPlusIQ 型激光共聚焦显微镜 488nm 氩激光激发而产生荧光,测定其荧光强度.按参考文献】,通过Cai 标定公式计算钙离子浓度:Ca2i=Kd(FF)/(F一 F),式中 Kd 为400nMol,F 为测量的相对荧光值 ,F为加入 IOM4 一 BrA23187 的高钙液(
11、10mmol/LK2CaEGTA,10mmol/LKmops,100mmol/LKC1,美国 BioRad 公司)后所得最大荧光值,F 为加入 IOM4 一BrA23187 的无钙液(10mmol/LK2H2EGTA,10mmol/LKmops.100mmol/LKC1)后所得最小荧光值.4.MTr 法检测细胞死亡率在培养板上每孔(含实验组和对照组) 加入 MTr 溶液(5mg/m1)2Ol,在 37,5%CO:及饱和湿度条件的孵箱中继续温育 4h 后终止培养,小心吸弃孔内上清液,可见孔内有不同数量的紫蓝色结晶物;每孔内加入 150txlDMSO,振荡 10min,使结晶物充分溶解.选择 49
12、0nm 波长,在酶标仪测定各孔光吸收值,记录结果.按以下公式计算死亡率:(P 为对照组死亡率,由台盼蓝染色计数法测得)细胞死亡率=(对照组光吸收值一实验组光吸收值)/对照组光吸收值P三,统计学处理实验数据均采用微机 SAS 软件系统处理,以xs 差表示,组间采用双样本异方差 t 检验进行统计学分析.结果与对照组相比较,光动力作用组 c6 胶质瘤细胞内游离钙明显升高(P0.01),随着光动力剂量的增加,平均胞内游离钙浓度增大,细胞死亡率逐渐升高,两者密切相关,见表 1.表 1 光动力作用对 c6 胶质瘤细胞内 【Ca2i 和死亡率的影响(;S)(n=15)Tab.1TheeffectsofPDT
13、onCaiinC6gliomacellandmortality注 Note:-k:与对照组相比 CompadwithcontrolgroupPO.05讨论PDT 是一种能诱导细胞坏死和凋亡的细胞毒性治疗方法,在细胞水平的光动力效应中,光敏剂在亚细胞定位后,在激发光作用下,通过各种信号途径诱导细胞坏死和凋亡.介导光动力引起各种细胞反应信号途径包括蛋白激活,去磷酸化,第二信?77?中国激光医学杂志 2003 年 5 月第 12 卷第 2 期ChinJLaserMedSurg,May,2003,Vol12,No.2使(钙离子 ,cAMP)的变化,另外 PDT 引起粘过分子和其他细胞表面受体如 12
14、类主要组织相容性复合物和各种细胞因子的表达变化一 1.目前,PDT 引发的信号途径还未完全阐明,而光敏剂的亚细胞定位能决定原发损害的位置,是影响:动力杀伤效应的重要因素,而第二信使钙离子与各种光敏剂亚细胞定位相关信号途径都有关.本实验应用激光共聚焦显微镜和细胞内 Ca 荧光探针 Fluo 一 3/AM 直接检测不同光动力剂量处理后单个 c6 胶质瘤细胞胞浆ca】i 变化 .实验发现:光动力作用组 c6 胶质瘤细胞内游离钙明显升高,平均胞内游离钙浓度随着光动力剂量的增加而增大.光动)丁作用后胶质瘤细胞钙离子浓度的变化提示 Ca 超载在光动力继发损伤过程中起重要作用.生理条件下,c6 胶质瘤细胞内
15、游离钙离子浓度很低(92.54-12.9nmol/L),光动力作用后胞内游离caJi 明显升高,大剂量(280J/cm)作用时可达到 3455.84-2142.8nmol/L,光动力作用引起胞内钙浓度升高的原因尚未完全明确,可能与以下几方面有关.(1)外钙进入:光动力作用引起质膜原发损害,细胞 K 大量外流,细胞膜去极化,使胞膜电压依赖性 ca 通道开放,大量胞外 ca 内流;光动力引起线粒体损伤,ATP 合成减少以及细胞 K 外流可使细胞无氧糖酵解增加,从而使 ATP 分解增加而合成减少,引起细胞内 ATP缺乏,细胞膜去极化及 ATP 缺乏,使问接依赖Na 一 KATPase 的 Ca 一
16、Na 交换泵出现反相交换,使大量 ca 内流;细胞膜去极化导致大量兴奋氨基酸释放,从而使 NMDA 受体激活,引起 ca,Na,cl 一的内流(2)细胞内钙库释放:光动力作用后线粒体膜电位的降低,引起被称作线粒体通透转换孔的大通道 l 开放,导致线粒体内 ca 释放;光动力作用后通过 PLCIP3 一 PLA 途径或直接激活 PLAz 引起钙离子从内部储存库释放,引起细胞内钙离子浓度升高一 I.(3)钙调节能力下降:光动力引起线粒体损伤,ATP 合成减少以及细胞 K 外流可使细胞无氧糖酵解增加,引起细胞内 ATP 缺乏,导致细胞胞膜上 ca一 ATP 酶活性抑制,细胞内Ca 外排减少.以上三方
17、面作用导致细胞钙超载.而体外实验研究发现,随光动力治疗剂量增加,肿瘤细胞的死亡率逐渐增加,这可能与 Ca 参与许多生理和病理调节过程有关,Ca 超载对细胞有多方面损害作用:(1) 抑制细胞能量代埘 :ca.与线粒体膜有效结合,阻断线粒体电子转移,抑制 ATP 产生,?78?使 ATP 依赖性细胞内活动停止及乳酸堆积;细胞内游离钙升高抑制糖酵解的酶类,进一步加重能量代谢障碍.(2) 激活细胞内多种酶系统,影响细胞结构和功能,加重细胞毒作用:如,激活中性蛋白酶,从而降解神经微丝,微管及其它结构蛋白;激活磷脂酶 c,A,降解膜磷脂 ,最终形成大量氧自由基,导致脂质:过氧化反应,破坏细胞膜结构,造成膜
18、流动性和完整性破坏,使细胞膜通透性增加,最终导致细胞毒性脑水肿形成使细胞膜流动性降低,通透性增加,细胞肿胀,崩解 I;Ca 激活中性蛋白酶,从而降解细胞内结构蛋白,使细胞核回缩,胞浆空泡形成;细胞内 Ca 增加激活核酸内切酶,使 DNA 片段化形成;Ca 激活 ca/钙调节蛋白依赖激酶(CAMK 激酶和蛋白激酶 C(PKC),从而磷酸化某些受体或通道,从而使受体或通道功能改变,抑制蛋白质的合成 I.(3)增加自由基形成:细胞内ca 增加激活磷脂酶(尤其 PI|A:),导致膜磷脂降解,花生四烯酸堆积,随后通过环氧化酶和脂氧化酶的氧化途径产生大量自由基;细胞内 Ca 增加使黄嘌呤脱氢酶转化成黄嘌呤
19、氧化酶,进而氧化黄嘌呤及次黄嘌呤形成尿酸,同时伴随超氧阴离子形成I“;细胞内 Ca 增加刺激一氧化氮合成酶 (NOS)生成,产生大量 NO,NO 与超氧阴离子反应形成过氧化氮,最终形成具有破坏力的自由基.1.(4)诱导细胞凋亡:大量实验证实胞浆 ca 与细胞凋亡关系密切.McConkey 等认为通过 ca 两条途径诱导细胞凋亡.一是胞内 ca 库释放 ,胞外 ca 内流促使胞浆 ca.持续升高,作为凋亡信号启动细胞凋亡 ,二是 ca 的释放打破了细胞内结构的稳定 ,使得细胞凋亡效应系统的关键成分开始和细胞结构正常时不能接触到的基质接触,从而触发细胞凋亡.胞浆 ca 浓度升高或分布改变 (red
20、istribution)诱发细胞凋亡变化的作用方式主要有如下几种;信号转导方式,激活蛋白酶方式,激活核酸内切酶方式,激活转谷氨酰胺酶方式等.因此,钙超载在光动力作用继发细胞损伤过程中起重要作用,是光动力效应链的重要环节.本实验表明,细胞内 ca 超载可能是光动力作用的重要机制之一.参考文献1GrynkiewiczG,PoenieM,TsienRY.AnewgenerationofCaindicatorswithgreatlyimprovedfluorescencepropertiesJ.JBiolChem,1985,260:34403450.中国激光医学杂志 2003 年 5 月第 12 卷第
21、 2 期ChinJLaserMedSurg,May2003,Vol12,No.22ComerCJ,FeafioA,HayashiN,eta1.Molecular,cellular,andtissueresponsesfollowingphotodynamictherapyJ.LasersSurgMed.1988.8:450463.3AgarwalML,LarkinHE,ZaidiSI,eta1.PhospholipaseactivationtriggersapoptosisinphotosensitizedmouselymphomaceilsJ.CancerRes,1993,53:589759
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26、治疗多以手术为主.近年来我科应用 CO 激光治疗口腔粘液腺囊肿 55 例,取得了满意的治疗效果,现报告如下.资料与方法1.一般资料在 55 例患者中,男性 33 例,女性 22 例;年龄在 1450 岁,平均年龄 32 岁,以中青年居多.其中发生在下唇 49 例,颊黏膜 4 例,舌尖 2 例,以下唇为主.多为咬唇损伤所致.病程 1 个月至 1 年.囊肿直径在 0.51cm,其中有 9 例为手术治疗后复发的病例.2.治疗方法局部常规消毒,铺无菌洞巾,用 5 号细针头抽取 1%利多卡因作囊肿周边及基底浸润麻醉.我们应用上海产 CO 激光机,激光波长 10.6m,输出功率 1025w,光斑直径0.7mm.将光纤输出端对准囊肿表面,从外向内
