1、第三章 细胞因子细胞因子（Cytokine）是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽。天然免疫和特异性免疫的效应阶段大部分是由细胞因子介导的。细胞因子作为免疫活性细胞间相互作用的介质（mediator） ，对免疫应答的发生、调节及效应等均起重要作用。第一节 细胞因子的概述一、细胞因子的概念和分类细胞因子：细胞分泌的具有免疫调节和调节活性的多肽分子，包括：淋巴因子（Lymphokine）：淋巴细胞产生的细胞因子单核因子（Monokine）：单核巨噬细胞产生的细胞因子白细胞介素（IL）：介导白细胞间相互作用的细胞因子，包括 IK-1IL-23。集落刺激因子（CSF）：刺激造血干/祖细胞的细胞
2、因子，包括 Multi-CSF(IL-3),GM-CSF,G-CSF,M-CSF，红细胞生成素（ Epo） ，干细胞因子（SCF） ，白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF） ，血小板生成素（Tpo ）等。干扰素（IFN）：抑制病毒复制，调节免疫应答的细胞因子，包括IFN ， IFN ，IFN 等肿瘤坏死因子（TNF）：具有诱导肿瘤凋亡效应的细胞因子，包括TNF ， TNF （LT ） ，LT ，TRAIL， FAS 配体等。趋化因子（Chemokine）：具有吸引白细胞到局部效应的细胞因子，根据分子结构分为4 种亚家族，包括 CXC，CC，C 和 CX
3、3C 亚家族。TGF （Transforming growth factor ）超家族：包括 TGF 1，2，3、 inhibin 、BPM-2-15 （ Bone morphogenetic protein-2-15）等。生长因子（Growth factor）：对细胞具有促生长作用的细胞因子，包括 IGF-1，EGF， PDGF， FGF， VEGF 等。有关细胞因子命名和情况介绍的资料，可以检索下列网站：http:/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/http:/www.copewithcytokines.de/cope.cgi二、细胞因子的产生1、活化的淋巴细
4、胞（特别是 Th1、Th2 细胞） 、活化的单核巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等表 1 Th1 和 Th2 细胞的作用特点Th1 Th2细胞因子分泌 IL-2，IFN ，IFN ，IL-3，GM-C IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，SF，IFN IL-13，GM-CSF，TNF 免疫应答 细胞免疫， 迟发性变态反应 体液免疫，速发性变态反应，疟疾免疫防御 Leichmania(保护性作用),HIV 感染， （晚期抵抗作用） ，妊娠（胚胎保护）疟疾(早期抵抗作用 ),结核病(保护作用) 免疫病理效应 自身免疫性脑脊髓炎,I 型糖尿病,自 Leischmania（易感作用）
5、 ，HIV 感染 身免疫性甲状腺疾病，Crohns 病， 发展至 AIDS，结核（加重病程） ，慢急性移植排斥,类风湿性关节炎,多 性移植物抗宿主反应，哮喘，春季结发性硬化症，习惯性流产 膜炎，系统性红斑狼疮 2、肿瘤细胞，如 Jurkat 细胞、VWHI-3 细胞、骨髓瘤细胞等3、通过基因工程技术在工程细胞生产重组细胞因子。第二节 细胞因子的结构、特征和功能一、结构1、小分子蛋白2、单链或双链，多含糖基二、共同特征1、微量而活性强2、常与靶细胞表面特异性受体结合而发挥效应。主要有旁分泌（Paracrine）或自分泌（Autocrine） 。3、合成和分泌是一个短暂、自我控制的过程。4、同一种
6、细胞因子可由多种不同类型的细胞产生；5、多相性，网络性效应6、可引起病理反应，如炎症、休克、发热、恶液质。表 2 细胞因子引起的病理反应细胞因子 病理反应 拮抗剂适应症IL-1 发热,炎症 ,休克,低血压, 胰岛细胞 炎症性疾病，休克，类风湿关节炎，糖尿毒性 病, 白血病等IL-2 发热, 渗透综合征, 贫血，低血压 移植排斥, 自身免疫病IL-3 发热，流感样症状，刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞, 刺激白血病细胞IL-4 发热, 促进 IgE 产生, I 型变态反应 哮喘等 I 型变态反应IL-6 发热，炎症，刺激骨髓瘤细胞 骨髓瘤，炎症性疾病IL-8 炎症 炎症性疾病IL-9 哮喘 哮喘GM-
7、CSF 发热,流感样症状,刺激白血病细胞 白血病INF 发热,炎症,恶液质,休克 休克,炎症性疾病,恶液质,类风湿关节炎IFN 发热,流感样症状,炎症 炎症性疾病 TPO 骨髓纤维化,微血栓形成 EGF 刺激某些肿瘤细胞增殖 肿瘤bFGF 刺激某些肿瘤增殖、转移 肿瘤三、细胞因子的功能1、作为天然免疫的介质，具有此种功能的细胞因子是由感染性因子刺激单核巨噬细胞产生的；2、参与淋巴细胞的活化、生长和分化，这些细胞因子是在 T 细胞对特异性抗原识别的过程种诱发产生的；3、在免疫-炎症反应中，对炎性细胞起调节作用，细胞因子激活 T 细胞在特异性抗原识别过程中诱发产生的非特异性炎性细胞；4、刺激未成熟
8、白细胞的生长和分化，此种细胞因子是由被激活的淋巴细胞和其他细胞产生的。一种细胞因子可能表现出一种以上的生物学功能。表 3 已批准上市的细胞因子基因工程药物名称 适应症IFN 白血病、Kaposi 肉瘤、肝炎、癌症、AIDSIFN 慢性肉芽肿、生殖器疣、过敏性皮炎、感染性疾病、类风湿关节炎G-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、AIDS 、白血病、再生障碍性贫血GM-CSF 自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、AIDS、再生障碍性贫血Epo 慢性肾衰导致的贫血、癌症或癌症化疗导致的贫血、失血后贫血IL-2 癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂IFN 多发性硬化症IL-11 放化疗所致血小板减少症
9、干细胞因子（SCF） 与 G-CSF 联合应用于外周血干细胞移植EGF 外用药治疗烧伤、溃疡bFGF 外用药治疗烧伤、外周神经炎表 4 正进行临床实验的细胞因子基因工程药物细胞因子名称 适应症IL-10 炎症，银屑病，Crohns 病，类风湿关节炎IL-12 肿瘤，HIV 感染，I 型变态反应Tpo 血小板减少症IFN 多变体 肿瘤Flt3/flk3 Ligand (FL) 肿瘤TGF- 肿瘤大剂量化疗 Keratinocyte Growth 慢性皮肤溃疡、多发性硬化症Factor-2 (KGF -2) 促进烧伤，慢性溃疡的伤口愈合，抗癌药物引起的粘膜损伤，炎症性肠道疾病MIP -1 变异体
10、肿瘤化疗的骨髓保护作用OPG (osteoprotegerin ) 骨质疏松Mulitkine（白细胞产生 转移性肿瘤的细胞因子混合制剂）B 细胞刺激因子(Blys) 免疫缺陷四、细胞因子受体1、造血生长因子受体家族2、Ig 超家族3、TNF 受体家族4、趋化因子受体家族5、TGF 受体超家族第三节 细胞因子的检测一、生物活性检测法检测细胞因子的生物学活性：1、促增殖依赖性细胞株（CTLL、PDC-P1 、TF-1、NSF60） ；2、功能测定：趋化活性测定；干扰病毒复制、杀肿瘤细胞效应等。二、免疫学检测法检测细胞因子蛋白质的抗原特性：1 可溶性细胞因子检测： 2 细胞膜上细胞因子或受体的研究
11、3 检测细胞内的细胞因子三、分子生物学检测法检测细胞因子的 mRNA 表达：1 分子杂交试验：测定 mRNA 水平的细胞因子表达2. RT-PCR 技术 ：测定 mRNA 水平的细胞因子表达第四节 细胞因子的应用一、细胞因子的临床应用1、重组细胞因子用于治疗各种疾病，如肿瘤、感染、造血功能障碍等(表 3,4)2、细胞因子抑制剂用于治疗炎症、自身免疫病、移植排斥、休克等（表 5）3、细胞因子检测用于判断机体免疫功能，进行疾病的辅助诊断，判断病程，预后，评价治疗效果4、重组细胞因子可作为佐剂与疫苗共用，预防感染性疾病5、细胞因子基因治疗（表 6）表 5 进入临床实验的细胞因子抑制剂名称 适应症可溶
12、性 IL-1 受体（干粉吸入剂） 哮喘可溶性 IL-1 受体（注射剂） 急性髓样白血病IL-受体拮抗剂 败血性休克，类风湿关节炎可溶性 IL-4 受体 哮喘抗 IL-4 人源化抗体 哮喘抗 IL-5 人源化抗体 哮喘可溶性 TNF 受体 II-Fc 融合蛋白 类风湿关节炎，慢性心衰可溶性 TNF 受体 I -Fc 融合蛋白 休克，类风湿关节炎，多发性硬化症抗 TNF 单抗（inflixmab） Crohns 病人源化抗 HER2（EGFR2）单抗 乳腺癌转移DAB389 -IL-2（IL-2 免疫毒素） T 细胞淋巴瘤，I 型糖尿病，严重类风湿关节炎，牛皮癣，HIV 感染DAB389 EGF
13、肿瘤人源化抗 VEGF 单抗 晚期肺癌，肠癌抗 VEGFR2 （KDR）嵌合抗体 转移性肠癌人源化抗 IL-8 抗体（ ABX-IL8） Severe psoriasisIL13-PE38QQR （IL-13 免疫毒素） 肾癌TNF 反义寡核苷酸 类风湿关节炎，牛皮癣抗 eotaxin 抗体 变态反应二、细胞因子的研究热点1、新细胞因子的基因克隆化2、细胞因子受体的基因克隆化3、细胞因子信号转导机制4、新一代细胞因子：高活性，多功能，低毒副作用，长半衰期，高稳定性5、细胞因子作为生物应答调节剂（BRM）的临床应用6、细胞因子表达调控7、细胞因子基因治疗（表 6）表 6 进入临床实验的细胞因子基
14、因治疗细胞因子 载体 适应症 导入方式IL-2 Retrovirus 晚期肿瘤,脑肿瘤,肠癌, 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人小细胞肺癌,骨髓瘤,神 经胶质瘤,肾细胞癌IL-2 脂质体 晚期肿瘤 脂质体包裹质粒的局部注射IL-2 脂质体 晚期肿瘤 脂 I IL-2 脂质体 晚期肿瘤 脂质体包裹质粒转染纤维母细胞和自身肿瘤细胞 IL-4 Retrovirus 晚期肿瘤,脑肿瘤,骨髓瘤 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人 IL-12 Retrovirus 晚期肿瘤 导入纤维母细胞后直接肿瘤局部注射TNF Retrovirus 晚期肿瘤 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人IL-2 Retrovi
15、rus 脑肿瘤 注射基因改造的成纤维细胞和肿瘤细胞IL-2 脂质体 乳癌,淋巴瘤,前列腺癌 脂质体包裹质粒转染自身肿瘤细胞IL-2 腺病毒 肠癌，肺癌 肿瘤内注射IL-7 肠癌,淋巴瘤,骨髓瘤,肾癌 Electroporation（电穿孔）IL-2 Retrovirus 肺癌 胸腔内注射GM-CSF Retrovirus 骨髓瘤，肾细胞癌 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人IFN Retrovirus 骨髓瘤，神经胶质瘤 , 前列腺癌 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人 IL-7 Retrovirus 骨髓瘤 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人IL-1，12 GM-CSF 骨髓瘤 基因枪IL-
16、2 腺病毒 神经胶质瘤 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人IL-2 AAV 质粒 卵巢癌 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人IL2+ IFN Retrovirus 导入自身肿瘤，作为肿瘤疫苗免疫病人VEGF 质粒, 腺病毒 外周动脉血管病，心肌梗塞 局部基因导入 IL-1ra Retrovirus 类风湿关节炎 滑膜细胞介导的关节内导入CTNF 肌萎缩性侧索硬化症 包裹（Encapsulated）的异源细胞导入 三、基因 Knockout 技术和 Knock-in 技术在细胞因子研究的应用（表 7）第五节 趋化因子一、概述趋化因子（chemokine）是一组结构和功能相似、分子量为 812KD
17、 的小分子细胞因子，其共同的功能特点是均具有对不同细胞的趋化效应。绝大多数趋化因子的蛋白质序列上都有4 个保守的半胱氨酸，根据第一和第二个半胱氨酸的位置，趋化因子可分为四个家族：CXC（ -趋化因子） ，CC （ -趋化因子） ，C （ -趋化因子） ，CX3C（ -趋化因子） 。C 为半胱氨酸，X 为非保守氨基酸。二、趋化因子的作用1、CXC 趋化因子（ -趋化因子）在 CXC 趋化因子家族中，前两个半胱氨酸被一个其它的非固定氨基酸隔开，根据该家族趋化因子氨基酸是否有 ELR（glutamic acid-leucine-arginine 谷氨酸- 亮氨酸-精氨酸）功能区，可分为 ELR 趋化
18、因子和非 ELR 趋化因子。ELR 趋化因子包括 IL-8，GRO（生长调控原癌基因，Growth regulated oncogene family）,ENA-78（上皮细胞来源的嗜中性粒细胞趋化物-78，Epithelial-derived neutrophil attractant-78） ，GCP-2 （粒细胞趋化物-2，Granulocyte chemotactic protein-2）和 NAP-2（嗜中性粒细胞活化蛋白-2，Neutrophil activating protein-2） ，绝大多数 ELR 趋化因子对嗜中性粒细胞有强烈的趋化活性，而对单核细胞没有作用；非ELR
19、趋化因子包括 IP-10（干扰素 诱导蛋白-10，Interferor- inducing protein-10） ， MIG（干扰素 诱导的表 7 基因 Knockout 技术在细胞因子研究的应用细胞因子或相关分子 表型IL-1ra LPS 诱导休克的敏感性升高，发育减慢IL-2 溶血性贫血，慢性肠炎，高 IgG1 和 IgEIL-4 IgE 缺陷，低 IgG1，Th2 细胞产生缺陷IL-7 B 细胞 T 细胞发育受损IL-6 骨质疏松，IgA 产生减少LIF 雌性不育IL-5 嗜酸性粒细胞缺陷，Th2 产生缺陷？ GM-CSF 肺部感染IL-10 贫血，炎症性肠道疾病IL-12 Th1 细
20、胞产生缺陷？IFN 多种免疫缺陷TGF- 炎症G-CSF 巨噬细胞，粒细胞的多种功能缺陷M-CSF 骨质疏松症TNF 无淋巴结和 PeyerspatchesSDF Pro-B 细胞和髓样祖细胞减少IL-2R NK 和 T 细胞缺陷，B-和 T-细胞发育缺陷IL-2R 溶血性贫血，高 IgG1 和 IgE，NK 细胞缺陷IL-7R B 和 T 细胞发育缺陷gp130 胚胎致死，心肌发育不良IL-3R 无病理改变？IL-3/GM-CSF/IL-5R 肺部疾病IFN / R 病毒防御功能受损IFN R 对 LPS 抵抗，对 Listeria 易感TNFR1（ p55） 对 TNF 抵抗，对 LPS
21、抵抗，对 Listeria 易感TNFR2（ p57） 对 TNF 抵抗IL-8R 淋巴结和脾脏肿大Jak-1 胚胎致死Stat-1 抑制 IFN ， ， 的功能Nf-IL-6 巨噬细胞功能受损趋化因子受体 R2 TH1 细胞功能缺陷，DTH 下降单核因子，Monokine induced by IFN- ）和 SDF（基质细胞来源因子-1，Stroma cell-derived factor-1） ，这些趋化因子是淋巴细胞或造血的高效趋化剂，对嗜中性粒细胞没有作用。实验证实：CXC 趋化因子参与血管形成，其中绝大多数 ELR CXC 趋化因子能够促进血管的生成，而非 ELR CXC 趋化因子
22、则对血管的生成起抑制作用。人类 CXC 家族趋化因子的来源及作用的靶细胞如表 8。2、CC 趋化因子（ -趋化因子）CC 趋化因子的第一个和第二个半胱氨酸相邻，其中 MCP1-5（单核细胞趋化活性蛋白1-5，Monocyte chemoattractant protein-1-5） ，MIP-1 ， ，MIP3 ， （巨噬细胞炎症蛋白 1 ， ，3 ， ， Macrophage inflammatory protein-1 ， ，3 ， ） ，RANTES（对活化和正常 T 细胞表达及分泌调控的蛋白质，Regulated on activation, normal T cell express
23、ed and secreted）和？ 等均含有 4 个保守的半胱氨酸，趋化单核巨噬细胞，淋巴细胞，嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞，对嗜中性粒细胞没有作用，而 Leukotactin-1，MRP-1，2 （巨噬细胞炎症相关蛋白 1,2, macrophage inflammatory protein related protein-1,2） ，CK 8 和 SLC/6Ckine 是近年来发现的含有 6 个保守的半胱氨酸的 CC 家族趋化因子，该类因子除了原有的 4 个半胱氨酸外，在 C 末端又多了一对半胱氨酸，可能能够形成第三对二硫键，它们有其特殊的功能，如 Leukotactin-1 与一般的 C
24、C 趋化因子不同，对嗜中性粒细胞有强烈的趋化作用，这可能是由其特征的结构决定的。CC 家族趋化因子除了 MIP-3 ，基因定位于 2 号和 9 号染色体，TARC 和 STCP-1 基因定位于 16 号染色体外，其它均定位于 17 号染色体，这说明它们可能在进化上与其它趋化因子的亲缘性较远。表 8 人 CXC 家族趋化因子的来源及作用的靶细胞趋化因子 来源 靶细胞IL-8 M, T, EP, EC N, T, B4ENA-78 EC, Platelets NGCP-2 Osteosarcoma cells NGRO- (MGSA) M, EC, Tumor cell NGRO- (MIP-2
25、) MC, CM, ME NGRO- (MIP-2 ) MC, CM, ME N IP-10 M, F, EC Activated T, TILMIG M Activated T, TIL NAP-2 Platelets N, BaFP-4 Platelets F, ECBLC Spleen, lymph node B, T, MSDP-1 Stromal cells T, CD34+Cells简称：Ba，嗜碱性粒细胞； CM，E， 嗜酸性粒细胞； EC，内皮细胞； EP，上皮细胞； L 淋巴细胞；M 单核/巨噬细胞； MC，肥大细胞； ME，MGSA，肿瘤生长刺激活性； N，嗜中性粒细胞；
26、PF-4，血小板因子-4 ； T，T 淋巴细胞； TIL，肿瘤浸润淋巴细胞。3、C 趋化因子（ -趋化因子）：Lymphotactin 是 C 家族趋化因子中的唯一成员。它只有趋化因子所具有的第二和第四个半胱氨酸。对 T 淋巴细胞有强烈的趋化作用，它的基因定位于 1 号染色体。4、CX 3C 趋化因子（ -趋化因子）：Fractalkine (neurotactin)是 CX3C 家族趋化因子中的唯一的成员，也是目前发现唯一的一种膜结合型的趋化因子，高表达于脑、心脏和肺组织。两个半胱氨酸之间有三个其它的氨基酸，它的基因定位于第 16 号染色体。膜结合型的 Fractalkine 对单核细胞和
27、T 淋巴细胞有强烈的趋化作用，而对嗜中性粒细胞没有作用。但是，重组的趋化因子功能区 neurotactin 在体内和体外均能趋化嗜中性粒细胞。三、趋化因子受体趋化因子是通过与相应的受体结合而发挥趋化作用的。趋化因子受体是与 G 蛋白偶联的有 7 次跨膜结构的受体家族。百日咳毒素（pertussis toxin）可通过阻断趋化因子的信号转导途径而封闭趋化因子的作用。根据结合的受体不同，趋化因子受体可分为 5 大类：CXC受体，CC 受体，C 受体，CX3C 受体和 C 受体。Orphan 受体是指目前还没有发现其相应配体的受体。迄今发现，CXC 受体有 5 种，CC 受体有 10 种，C 受体
28、1 种，CX3C 受体 1 种，Orphan 受体有 3 种，具体见下表。另外，有些病毒也能编码趋化因子受体，如 CMV 病毒能编码一种趋化因子受体 US28， 能与 RANTES， MCP-1， MIP- ，和 MIP- 结合。近年来的研究发现，趋化因子及其受体与 HIV 感染有密切关系。众所周知，CD4 分子是 HIV 的重要受体，但表达 CD4 的鼠细胞对 HIV 仍不易感。这表明在 HIV 的感染过程中，除了 CD4 分子外，还需要其它共受体的存在。研究者们发现，RNATES， MIP- 和 MIP- 能够阻断嗜巨噬细胞型的 HIV-1 感染，而它们的受体 CCR-5，是嗜巨噬细胞型
29、HIV-1 的主要受体。CXCR4 （fusin）是嗜 T 细胞型 HIV-1 的共受体，其配体 SDF-1 能阻断相应 HIV-1 的感染。CCR-5 的缺失突变，对 HIV-1 的感染有很强的抵抗性或能延缓爱滋病的发生。另外，某些特殊的 HIV 毒株，还能以 CCR2 和 CCR3 为共受体，某些 orphan 受体 STRL33和 BOB 可作为 SIV 和 HIV 的共受体。通过 HIV 与趋化因子关系的研究，趋化因子及其受体也许可用于 HIV 的预防和治疗。趋化因子的作用广泛，除了趋化作用及与 HIV 感染之间的密切联系外，还能够调控造血祖/ 干细胞的增殖，促进或抑制血管形成，对肿瘤
30、的发生、发展和转移有重要的影响，广泛参与机体的多种生理和病理过程。附：人 IL-8 DNA 序列和氨基酸序列 （实验课用）DEFINITION Homo sapiens, interleukin 8, clone , mRNA, complete cds 1605 bpSOURCE Homo sapiensCDS 41 340/translation=“MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS“1 gaagaaacca ccggaagga
31、a ccatctcact gtgtgtaaac atgacttcca agctggccgt61 ggctctcttg gcagccttcc tgatttctgc agctctgtgt gaaggtgcag ttttgccaag121 gagtgctaaa gaacttagat gtcagtgcat aaagacatac tccaaacctt tccaccccaa181 atttatcaaa gaactgagag tgattgagag tggaccacac tgcgccaaca cagaaattat241 tgtaaagctt tctgatggaa gagagctctg tctggacccc a
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