1、反应停对 HL-60 细胞马利兰耐药的逆转作用?300?郑州大学 (医学版)2005 年 3 月第 40 卷第 2 期反应停对 HL.60 细胞马利兰耐药的逆转作用杨义明杜钢军林海红张水兰1)河南大学第一附属医院肿瘤科开封 4750012)河南大学药学院药理学教研室开封 475001男,39 岁,大学本科,副主任医师,研究方向:肿瘤临床和应用基础研究关键词反应停;马利兰;HL 一 60;耐药性中图分类号 R733.72.摘要目的:研究反应停对 HL_60 细胞马利兰耐药的逆转作用 .方法:低剂量马利兰反复刺激 HL-60 细胞造成HL-60 马利兰耐药细胞株,联合应用反应停加马利兰观察反应停对
2、马利兰耐药HL-60 细胞的逆转作用 ,并检测细胞谷胱甘肽(GSH),血管内皮生长因子(VEGF)和细胞色素 c 水平.结果: 马利兰对 HL-60细胞的,c.为 5.44mmoL/L,对马利兰耐药 HL-60 细胞的 IC.100mmol/L;反应停单独应用对马利兰耐药 HL-60 细胞生长无影响,但能使马利兰对马利兰耐药 HL 一 60 细胞的,c.降至 l4.34mmol/L,同时降低细胞 GSH,VEGF 和升高细胞色素 c 水平.结论: 反应停对 HL-60 细胞马利兰耐药有逆转作用,其机制可能与降低细胞 GSH,VEGF 和升高细胞色素 c 水平有关.Reverseeffect0f
3、thalidomide0nmyleranresistantHL 一 60cells,YANGYiming“,DUCang,iun,LINHaihong,ZHANGShuilan)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversity,Kang4750012)PharmaceutialCollege,HenanUniversity,Kaifeng475001Keywordsthalidomide;myleranresistant;HL-60;reverseAbstractAim:Tostudythereverseeffect
4、ofthalidomideonmyleranresistantHL-60cells.Methods:MyleranresistantHL 一60cellswaspreparedbystinmlatingrepeatedlywithlowdoseofmyleranReverseeffectofthalidomideonmyleranresistantHL 一60cellswasobservedbytreatmentwiththalidomidecombinedwithmyleran.ThelevelsofGSH.VEGF.andcytochromeCweremeasured.Results:IC
5、50ofmyleranonnormalHL-60andmyleranresistantHL-60were5.44mmol/Land100mmol/L,respectively.ThalidomidealonehadnoeffectongrowthofmyleranresistantHL-60cellsbutreducedIC50ofmyleranto14.34mmol/L,decreasedthelevelsofGSHandVEGFandincreasedthereleaseofcytochromeC.Conclusion:Thalidomidecanreversemyleranresista
6、ntHL 一60anditsmechanismmightberelatedtoreductionofGSHandVEGFandincreaseofcytochromeC.反应停(thalidomide)化学名肽胺哌啶酮,在 20世纪 50 年代曾作为镇静药,止吐药使用,但因其有很强的致畸作用而被淘汰.近年来有研究表明反应停在一些动物肿瘤模型及临床治疗中有较好的抗肿瘤作用.为观察反应停对 HL-60 纽胞马利兰耐药性的逆转效应,作者进行了如下研究.1 材料与方法.一11 药物,试剂及仪器反应停,江苏常州制药厂,批号 20030405,注射用水溶解为适当浓度.马利兰,上海华联制药厂,批号 2003
7、0608.RPMI.1640和 MTT,Sigma 产品.胎牛血清,天津百叶生物制品公司产品.青霉素和链霉素,华北制药厂产品.人细胞色素 c 和人血管内皮生长因子(VEGF)免疫酶联试剂盒,Quantikine 产品.谷胱甘肽(GSH). 检测试剂盒,南京建成生物工程研究所产品.其余试剂均为分析纯.550 型酶标仪,Bio.RAD 公司.CO,培养箱,NAPCO 公司.倒置显微镜,JapanNikon 公司.RT7 型平板离心机,SORVALL 公司.1.2HL-60 细胞培养 HL-60 细胞由河南大学药学院细胞室提供,生长在含体积分数为 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中,于体
8、积分数为 5%CO,培养箱中 37培养.1.3 马利兰耐药 HL-60 细胞株的诱导取 HL-60细胞,于含 1mmol/L 马利兰的 RPMI-1640 完全培养基中培养,每周传代 1 次,同时检测细胞对马利兰的JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)Mar.2005Vo1.40No.2敏感性.当细胞半数抑制浓度(,C.)100mmol/L,且连续传 10 代保持恒定时为耐药株.1.4 细胞活性检测采用 MTT 检测法稍作改变后进行.取对数生长期的 HL.60 细胞或 HL-60 马利兰耐药细胞,用含体积分数为 10%胎牛血清的RPMI 一
9、1640 培养基稀释为细胞数 3X10ml 一,以100l/:fL 接种于 96 孔板,于体积分数为 5%CO,37培养 24h 后,根据所设剂量组(实验设对照组 1个组;马利兰 7 个剂量组,终浓度(单位为 mmol/L)分别为 1,3,10,20,40,80,150;反应停 8 个剂量组,终浓度(单位为 mmol/L)分别为 1,3,10,20,40,80,150,300;反应停+马利兰 21 个剂量组,其中马利兰的终浓度同上,反应停的终浓度(单位为 mmol/L)分别为 10,30,100,每组 4 个复孔)添加含相应药物的相同培养基 100l/孔,继续培养 48h.加含 MTT5g/L
10、 的 PBS(pH6.8)20l/孔 ,培养 4h 后,1000r/min 离心 10min,弃上清液,加入二甲基亚砜 100l/孔,微量振荡仪振荡 5min,用酶标仪 570nm 测定各孔吸光度值(A 值). 按下列公式计算细胞生长抑制率:生长抑制率=(正常对照组 A 值一用药组A 值)/正常对照组 A 值)X100%.1.5GSH,VEGF 和细胞色素 C 水平检测采用相应的商业试剂盒进行检测.HL 一 60 马利兰耐药细胞(每瓶 10 细胞/3m1)接种于 25cm 培养瓶培养24h,补充 3ml 含不同浓度反应停(0,10mmol/L,30mmol/L,100mmol/L,300mmo
11、l/L)的新鲜培养基继续培养 48h.收集无细胞培养上清用于检测GSH 和 VEGF,细胞被洗 2 次后加裂解缓冲液(25mmol/LHEPES,5mmol/LMgC12,5mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,2mmo1/LPMSF,10Ing/L 胰肽酶 A,10mg/L 亮肽素)1ml/10 细胞,室温轻摇孵育 1h.1000r/min 离心 15min,以 BSA 为标准,用 Lowry法测上清总蛋白浓度.GSH,VEGF 和细胞色素 c的定量按试剂盒过程进行,微板读数仪测吸光度,最终结果以mol/g 表示.1.6 统计学处理数据用表示,采用方差分析和 q 检验,检验水准仅=0.
12、05.2 结果马利兰对 HL 一 60 细胞的,C.为 5.44mmol/L,对马利兰耐药 HL.60 细胞的/C.100mmol/L;300mmol/L 反应停单独应用对 HL-60 细胞及马利兰耐药 HL-60 细胞生长均无影响.反应停 30mmol/L即能使马利兰对马利兰耐药 HL 一 60 细胞的,c 降至14.34mmol/L,同时降低细胞 GSH,VEGF 和升高细?301?胞色素 C 水平;当反应停的浓度增至 100mmol/L时,与 30mmol/L 比较,马利兰对马利兰耐药 HL-60细胞的抑制效应没有继续增强.见表 1,表 2.表 1 药物对细胞生长抑制的 IC5ommol
13、/L组别马利兰耐药 HL_6OHL_6O与马利兰+反应停 30mmol/L 同细胞组比较,#P0.05;与马利兰同细胞组比较.P0.05表 230mmol/L 反应停对马利兰耐药HL 一 60 细胞 GSH,VEGF 和细胞色素 c 水平的影响与对照组比较,P0.05,#P0.013 讨论马利兰为治疗慢性粒细胞白血病的化疗药物,虽然目前公认骨髓移植是治愈白血病的最佳方法,但限于骨髓来源及移植前需要化疗,马利兰在白血病治疗方面仍是重要的一线化疗药物.然而,肿瘤细胞对马利兰耐药也一直是导致治疗失败的主要原因之一,如何克服马利兰耐药成为临床主攻的难题.反应停有抗新生血管 I 形成作用,现已成为多发性
14、骨髓瘤治疗的一线药物之一.近来的研究显示反应停是一类作用较强的环氧化酶抑制剂.有报道显示环氧化酶能增强马利兰的抗肿瘤作用,作者考虑反应停在抗肿瘤方面的多靶点效应,推测其与马利兰合用可能有益.本研究结果表明,反应停单独应用虽然对马利兰耐药的 HL-60 细胞生长无影响,但能使马利兰对马利兰耐药 HL 一 60细胞的,c.降至接近 HL-60 细胞的,c 对 HL 一 60细胞的马利兰耐药有逆转作用.肿瘤细胞耐药的机制有多种,目前认为肿瘤细胞 GSH,VEGF 升高及凋亡减少是耐药的主要原因之一.反应停是新生血管形成抑制剂,对多种肿瘤细胞有直接诱导凋亡作用,因此作者推测反应停逆转 HL 一 60
15、细胞可能与调节耐药相关因子有关.本研究结果表明,反应停能降低细胞 GSH,VEGF 和?302?升高细胞色素 c 水平,直接证明了作者的推论 ,这也可能是反应停逆转耐马利兰 HL 一 60 细胞的主要机制.鉴于本试验仅是在体外进行,其结果是否与体内结果相符,有待进一步研究.参考文献2345MacphersonGR,FranksM,Tomoaia-CotiselA,eta1.Cur-rentstatusofthalidomideanditsroleinthetreatmentofme.tastaticprostatecancer.CritRevOncolHematol,2003,46(Supp1
16、):$49SinghalS.MehtaJThalidomideincancer.BiomedPharma-cother,2002.56(1):4杜钢,林海红,许启泰.托盘根提取物对不同细胞的影响.?f1 同药科大学,200l,32(6):468RakK.Currenttherapyofchronicmyeloidleukemia.OrvHetil.2003.144(9):405CasperJ.KnaufW.KieferT.eta1.Freosulfanandfludara-bine:anewtoxicity-redu(edconditioningregimenforalloge-neichem
17、atopoieticstemcelltransplantati()n.Blood,2004,l03(2):725郑州大学(医学版)2005 年 3 月第 40 卷第 2 期6RichardsonP,HideshimaT,AndersonK.Thalidomideinmultiplemyeloma.BiomedPharmacother,2002,56(3):ll57TomomiNoguchi,RumikoShimazawa,KazuoNagasawa.eta1.Thalidomideanditsanaloguesascyclooxygenaseinhibi-tors.BioorgMedChemL
18、ett,2002,l2(7):l0438SpiethK,KaufmannR.GilleJ.Metronomicorallow.dosetreosulfanchemotherapycombinedwithcyclooxygenase.2in.hibitorinpretreatedadvancedmelanoma:apilotstudy.CancerChemotherPharmacol,2003,52(5):3779 李文成.膀胱癌化疗耐药机制的研究进展重庆医学,2002,31(4):339l0 黄伟.线粒体基组与肿瘤耐药研究进展.国外医学 -肿瘤学分册,200l,28(5):348ll 魏寿江.
19、肿瘤耐药性研究的新进展.围外医学?l 临床生物化学与检验学分册,200l,22(1):30l2LiL.LuanY.WangG.eta1.Developmentandcharacter.izationoffivecellmodelsforchemoresistancestudies0fhu.manovariancarcinoma.IntJMolMed,2004.14(2):257(2004-09-l3 收稿责任编辑赵秋民 )肝细胞癌组织中血管内皮生长因子-C 的表达彭利王顺祥张凤瑞唐瑞峰张萌河北医科大学第四医院肝胆外科石家庄 050011男,32 岁,博士生,主治医师,研究方向:肝胆肿瘤微血管生
20、成及侵袭转移 ,E-mail:关键词肝细胞癌;血管内皮生长子.C;侵袭;转移中图分类号 R735.7摘要目的:探讨肝细胞癌组织巾血管内皮生长子(VEGF)一 c 的表达.方法: 应用免疫组织化学方法检测43 例肝细胞癌及癌旁组织,24 例正常肝组织巾 VEGF-C 的表达.结果:肝癌,癌旁和正常肝组织巾 VEGF.C 阳性表达率分别为 72.1%(3l/43),23.3%(10/43)和 l2.5%(3/24),肝癌组织与癌旁组织VEGFC 表达率差异有统计学意义(=5.82.P0.05).癌组织巾 VEGFC 的表达门静脉癌栓,肝门淋岜结转移和复发有关(P0.05).结论:VEGFC 与肝细
21、胞癌侵袭转移相大 .ExpressionofVEGFCinhepatocellularcarcinomatissuePENGLi,WANGShunxiang,ZHANGFengrui,DepartmentofHepatobilia0Surgery,theFourthTANGRuireng,ZHANGMengHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shifiazhuang050011Keywordshepatocellularcart,inoma;VEGFC;invasion;metastasisAbstractAim:TodetecttheexpressionofVEGFCinhepatocellularcarcinomatissue.Methods:TheexpressionofVEGFCin43casesofhepatocellularcarcinomaandtheadjancenttumortissue,and24casesofnormaltissueweredetected
