1、*技术与方法*基于多重PCR-质谱微测序技术的结核分枝杆菌对一线治疗药物耐药性检测系统构建徐晓娜1,2,3，赵欣2，欧喜超4，肖迪2，宋衍燕3，赵雁林4摘要：目的构建一种基于多重聚合酶链式反应-质谱微测序技术的结核分枝杆菌耐药基因多位点检测方法和检测模块，实现结核分枝杆菌对一线抗结核药物的高通量快速检测，为结核病诊疗提供一种新型技术支撑。方法通过对5个单核苷酸多态性位点靶基因进行多重PCR扩增、单碱质量探针延伸及分子质量测定，同时完成16个突变位点、26种突变型的检测，实现结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一线治疗药物抗性的通量检测。采用40例结核分枝杆菌样本、50例呼吸道感染
2、患者咽拭子样本进行检测体系准确性及特异性验证。结果本研究构建了基于5重PCR-质谱联用的结核分枝杆菌对一线治疗药物的泛耐药检测方法，并开发了质谱配套检测系统。采用该系统，结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇抗性检测的准确率和特异性均为100.00%，且具有7h内完成96个样本的检测通量。结论本研究构建的方法有操作简便、低成本、高通量特点，耐药位点检测全面且准确，并具扩展性，可根据需要增添新突变位点，在结核分枝杆菌耐药性检测中具有良好应用前景。关键词：结核分枝杆菌；一线治疗药物；耐药性；多重聚合酶链式反应-质谱微测序技术中图分类号:R211；R521 文献标志码:A 文章编号:100
3、39961（2023）05058608Constructionof Mycobacteriumtuberculosis resistancedetectionsystemforfirst-linetreatmentdrugsbasedonmultiplePCR-massspectrometrymini-sequencetechnologyXu Xiaona1,2,3,Zhao Xin2,Ou Xichao4,Xiao Di2,Song Yanyan3,Zhao Yanlin4.1.Baotou Medical college,Baotou 014040,Inner Mongolia,China
4、;2.National Institute for CommunicableDisease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,State Key Laboratory of InfectiousDisease Prevention and Control,Beijing 102206,China;3.Chaoyang District Center for Disease Control and Prevention,Beijing,Beijing 100021,China;4.Na
5、tional Tuberculosis Reference Laboratory National Center for Tuberculosis Control andPrevention China CDC,Beijing 102206,ChinaCorresponding authors:Xiao Di,Email:;Song Yanyan,Email:songyayancdc163com;Zhao Yanlin,Email:Abstract:ObjectiveToestablishamulti-locusdetectionmethodanddetectionmoduleforMycob
6、acterium tuberculosisdrugresistancegenebasedonmultiplexPCR-massspectrometrymini-sequencingtechnologyandtorealizethehigh-throughputrapiddetectionoffirst-lineanti-tuberculosisdrugsbyMycobacteriumtuberculosis,whichprovideanewtechnicalsupportfortuberculosisdiagnosisandtreatment.MethodsThroughmultiplexpo
7、lymerasechainreactionamplification,singlebasemassprobeextensionandmolecularweightdeterminationof5singlenucleotidepolymorphismlocustargetgenes,andthedetectionof16mutationsitesand26mutanttypeswerecompletedatthesametime,thefluxdetectionoftheresistanceofMycobacterium tuberculosistofirst-linetherapeuticd
8、rugssuchasrifampicin,isoniazid,pyrazinamideandethambutolwasrealized.Theaccuracyandspecificityofthedetectionsystemwereverifiedbyusing40samplesofMycobacteriumtuberculosisandthroatswabsamplesfrom50patientswithrespiratoryinfection.ResultsInthisstudy,apan-drugresistancedetectionmethodforfirst-linetherape
9、uticdrugsofMycobacterium tuberculosisbasedon5-plexPCR-massspectrometrywasconstructed,andamassspectrometrysupportingdetectionsystemwasdeveloped.Withthissystem,theaccuracyandspecificityofMycobacterium tuberculosisresistancedetectionofrifampicin,isoniazid,pyrazinamide,andethambutolwereall100.00%,andith
10、adadetectionthroughputof96samplesin7hours.ConclusionThemethodconstructedhasthecharacteristicsofsimpleoperation,lowcostandhighthroughput,comprehensiveandaccuratedetectionofdrugresistancesites,andscalability,andcanaddnewmutationsitesasneeded,whichhasgoodapplicationprospectsinthedetectionandanalysisofd
11、rugresistanceofMycobacterium tuberculosis.Keywords:Mycobacterium tuberculosis;Drugresistance;First-linedrugs;MultiplexPCRmassspectrometrymini-sequencingtechnology作者单位：1.内蒙古科技大学包头医学院,内蒙古包头014040；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室,北京102206；3.北京市朝阳区疾病预防控制中心,北京100021；4.中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心,国家结核病参比实验室,北京
12、102206作者简介：徐晓娜，女，内蒙古自治区乌兰察布市人，硕士研究生在读，主要从事病原菌耐药性新型检测方法构建，Email：；赵欣，女，山西省晋中市人，硕士，研究实习员，主要从事核酸质谱分析工作，Email：通信作者：肖迪，Tel：01058900704，Email：；宋衍燕，Tel：15711278611，Email：songyayancdc163com；赵雁林，Tel：010-58900777，Emal：徐晓娜和赵欣同为第一作者收稿日期：20230316网络出版日期：20230505586 疾病监测2023 年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2
13、023,Vol.38,No.5www.jbjc.org DOI:10.3784/jbjc.202303160107结 核 病 是 由 结 核 分 枝 杆 菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的一种危害人类健康的慢 性 传 染 病，是 我 国 面 临 的 重 要 公 共 卫 生 问 题 之一。根 据 2022年 全 球 结 核 病 报 告 1，2021年 全 球新发结核病患者1060万，较2020年增加4.50%，其中有45万 例 耐 利 福 平 结 核 病 新 病 例，较2020年 增加3.00%；死 于 结 核 病约160万 例，超过2020年 和2019
14、年 的 死 亡 数。我国2021年 的 新 发 结 核 病 患 者数 约为78.00万 例（2020年为84.20万 例），结 核 病发 病 率为55/10万（2020年为59/10万），在30个 结核 病 高 负 担 国 家 中 我 国 结 核 病 发 病 数 居第3位，占全球结核病例的7.40%。结 核 病 一 线 治 疗 药 物 有 异 烟 肼（isoniazid，INH）、利 福 平（rifampin，RIF）、吡 嗪 酰 胺（pyrazinamide，PZA）和乙胺丁醇（ethambutol，EMB）等，二 线 治 疗 药 物 有 阿 米 卡 星（amikacin，AMK）、卡那霉素
15、（kanamycin，KM）、卷曲霉素（capreomycin，CPR）、氟 喹 诺 酮 类 药 物 等 24。随 着 抗 结 核 药 物 的广泛使用，耐药性也逐渐严重，是目前结核病临床治疗 面 临 的 主 要 问 题。世 界 卫 生 组 织 将 耐 药 结 核 病 分为5个 类 别：异 烟 肼 耐 药 结 核 病（isoniazidresistanttuberculosis，Hr-TB）、利 福 平 耐 药 结 核 病（rifampicinresistanttuberculosis，RR-TB）、耐多药结核病（multi-drugresistanttuberculosis，MDR-TB）、准
16、 广 泛 耐 药结 核 病（pre-extensively drug-resistant tuberculosis，Pre-XDR-TB）及 广 泛 耐 药 结 核 病（extensive drugresistangcetuberculosis，XDR-TB）。MTB耐 药 机 制 复 杂，包 括 抗 菌 药 物 失 活、作 用靶点改变、靶点过度表达、药物外排以及前药激活中断 58，临床MTB菌 株 的 大 多 数 耐 药 性 与 染 色 体 突变 相 关 9。MTB耐 药 检 测 方 法 包 括 耐 药 表 型 检 测（传 统 药 物 敏 感 性 检 测、显 微 镜 观 察 药 物 敏 感
17、性 检测、基于代谢反应的耐药检测）、耐药基因检测（线性探 针 技 术、基 因 芯 片、基 因 测 序、GeneXpertMTB/RIF和XpertMTB/RIFultra技 术）、以 及 近 年 来 出 现 的基 于 质 谱 的 耐 药 性 检 测 技 术 914。传 统 药 物 敏 感 性检测是MTB耐药性检测的金标准，通过培养获得耐药 结 果，检 测 周 期 较 长。分 子 检 测 技 术 是 传 统 药 敏检 测 的 补 充，因 其 试 剂 昂 贵、操 作 繁 琐，不 适 合 推 广使用。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/io
18、nizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）已 广 泛 用 于 病 原 微生 物 分 析，具 有 操 作 简 便、高 通 量、高 分 辨 率 的 特点 1516。MALDI-TOFMS已 用 于 检 测 单 核 苷 酸 多态 性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs），实 现多 种 病 原 微 生 物 感 染的SNP检 测 诊 断 以 及 基 因 分型 1719。2014年Trembizki等 20 基于SNPs构 建 淋病 奈 瑟 菌 分 离 株 基 因 分 型 的 高 通 量 方 法，可 同 时 完成14
19、种SNP的检测。多重PCR-质 谱 微 测 序 技 术，是 将 多重PCR与MALDI-TOFMS联 合 用 于 基 因 突 变和SNP分 析 的技术，因是针对单个碱基的变异进行检测，故命名为多重PCR-质 谱 微 测 序（mPCR-MSmini-sequencing）技术18。本项目组已将该技术用于肺炎支原体分型和耐药联检、白纹伊蚊抗性检测、幽门螺杆菌耐药性检测1718。鉴于MTB耐药性检测需求，本研究针对抗结核一线药物，构建了MTB抗药性检测系统并开发了检测模块与国产质谱配套使用，为MTB耐药性检测提供新型技术支撑。1材料与方法1.1菌 株 与 标 本 选取40株 分 离于20142020
20、年MTB代 表 性 菌 株 进 行 耐 药 性 检 测 方 法 构 建 和 准 确性 验 证。选取50例 呼 吸 道 感 染 患 者 咽 拭 子 进 行 特异性验证。MTB菌株由中国疾病预防控制中心结核病 预 防 控 制 中 心 国 家 结 核 病 参 比 实 验 室 保 存，呼 吸道 感 染 样 本 由 北 京 市 朝 阳 区 疾 病 预 防 控 制 中 心 提供。所 有 菌 株 和 临 床 标 本 DNA提 取 均 使 用QIAampDNAMiniKit（QIAGEN）试 剂 盒 按 照 操 作说明提取。1.2结核分枝杆菌耐药靶基因选择与引物、延伸探针设 计 参 考 世 界 卫 生 组 织
21、 发 布 的 结 核 分 枝 杆 菌 复合 物 突 变 目 录 及 其 与 耐 药 性 的 关 系，对MTB一 线治疗药物（INH、RIF、PZA和EMB）常见耐药基因突变 位 点 进 行 分 析 筛 选（表1）。针 对 相 关 耐 药 基 因rpoB、katG、inhA、embB、pncA使 用 软 件PrimerPlex2设计PCR扩 增 引 物，引 物 的 长 度 范 围为1822bp，表1结核分枝杆菌主要耐药基因突变位点Table1Drugresistancegenemutationsitesof Mycobacteriumtuberculosis抗菌药物 耐药基因 位置 突变类型利福
22、平 rpoBQ513P CAACCAD516Y GACTACD516G/V GACGG/TCH526D/Y/N CACG/T/AACH526L/R CACCTCH531L/W TCGTTG异烟肼 katG S315T/N AGCAC/ACinhA 15 CT乙胺丁醇 embB M306V ATGGTGM306I ATGATC/A/TY319S/C TATTC/GTG406D GGCGACG406S GGCAGC吡嗪酰胺 pncA Q10P CAGCCGH57D CACGACT76P ACTCCT疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,202
23、3,Vol.38,No.5 587www.jbjc.org DOI:10.3784/jbjc.202303160107通 过 在 每 个 引 物的 5 端 添 加 10 bp的 固 定 序 列（ACGTTGGATG）使 每 个 引 物 的 分 子 质 量 超过9000（超 出 质 量 延 伸 探 针 的 质 量 范 围）（表2）。5个 耐药基因含有16个突变位点、26种突变型。使用基因位 点 分 析 设 计 系 统（V2.0，IntelliBio，China）设 计 突变 位 点的MALDI-TOFMS质 量 探 针，并 优 化 探 针序 列 以 及 浓 度（表3）。质 量 探 针 的 分 子
24、 质 量 要 求 为49000，长 度为1728bp，探 针 分 子 质 量 之 间 的最小差异设定为20。1.3mPCR-MSmini-sequencing检 测 方 法 建 立 及 参 数优 化 分 别 使用MTB耐 药 菌 株 核 酸 作 模 板 构 建 方 法、无 核 酸 水 作 空 白 对 照。通过PCR扩 增 目 标 序 列，加入 特 异 质 量 探 针，在 延 伸 探 针的3 端 位 点 上 通 过 延伸 一 个 不 同 质 量 的 碱 基 来 识 别 变 异 位 点。具 体 步 骤：（1）多重PCR扩 增：对 含 有 耐 药 基 因 突 变 位 点 的 目标 序 列 进 行 扩
25、 增。PCR扩 增 总 体 积 为 5 L，包含1LDNA模 板、2.00LPCR预 混 液、1.00LPCR引 物 混 合 物；扩 增 条 件：95预 变性15min；95 15s，59 30s，72 30s，35个循环；72 延 伸 5 min。（2）虾 碱 性 磷 酸 酶（Shrimp alkalinephosphatase，SAP）消 化：用SAP处理PCR产 物 以消 除 游 离 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 盐（dNTPs）。在PCR产 物中 加入2.00LSAP反 应 混 合 液，包 括 无 核 酸 水1.53L、SAP缓 冲液0.17L、SAP酶0.30L，37 40min、85
26、 5min条件下进行扩增。（3）质量探针延 伸（Massprobeextension，MPE）：制备4.00L的MPE反 应 混 合 液，包括1.00LE-ddNTP、1.40LMPE缓 冲 液、0.60 L MPE酶 和 1.00 L MPE引物，在 每个SAP产 物 中 加入4.00LMPE混 合 液；PCR条 件：95 30s；95 5s；52 5s，80 5s，40个 循 环，在 每 个 循 环 里 第 三 步 至 第 四 步 循 环5次，72延伸3min。（4）脱盐和纯化：延伸产物中加入14.00L无 核 酸 水 和 适 量 树 脂 后 瞬 时 离 心；将样品放置在翻转混匀仪中，翻转
27、混匀30min，混匀结束后离心取上清液待测。1.4数 据 采 集 与 分 析 取1.00L基质3-羟 基 吡 啶-2-羧 酸（3HPA）滴 在 样 本 靶 上，基 质 干 燥 结 晶 后，按 照体 积比11配 制 基 质 和 样 本 上 清 夜 的 混 合 液，取1.00L混 合 液 覆 盖 在 靶 孔 上，干 燥 结 晶 后 采用MALDI-TOF 质 谱（QuanTOFI，融 智 生 物 科 技 有 限 公 司，青 岛）进 行 数 据 采 集，参 数 设 定 及 数 据 分 析 如 前 所 述 18。1.5准 确 性 和 特 异 性 验 证 采用40株MTB菌 株 进表2结核分枝杆菌耐药基
28、因扩增引物序列Table2Sequenceofprimersfordrugresistancegeneamplificationof Mycobacteriumtuberculosis抗菌药物 基因 引物编号 引物序列（5 3）利福平 rpoBF1-rpoB acgttggatgAACCAGATCCGGGTCGGCATR1-rpoB acgttggatgTAACCACGCCGTCGACCACCTT异烟肼 katG F2-katG acgttggatgCTGGAGCAGATGGGCTTGR2-katG acgttggatgAGGTCAGTGGCCAGCATCfabG-inhA F3-fabG1
29、acgttggatgCCTCGCTGCCCAGAAAGGGAR3-fabG1 acgttggatgGTAACCAGGACTGAACGG乙胺丁醇 embB F4-embB acgttggatgCGACGCCGTGGTGATATTR4-embB acgttggatgACCGCTCGATCAGCACAT吡嗪酰胺 pncA F6-pncA acgttggatgGCGTCATGGACCCTATATCR6-pncA acgttggatgCTCGTCGACTCCTTCGAAG表3结核分枝杆菌MPE探针序列及其碱基延伸Table3MPEprobesequenceanditsbaseextensionof My
30、cobacteriumtuberculosis耐药基因突变位点 突变型 探针延伸序列（5 3）分子质量延伸1分子质量延伸2分子质量延伸3分子质量延伸4分子质量rpoB Q513PL A/C/T TTCGGCACCAGCCAGCTGAGCC 6681.40 A 6978.40 C 6954.40 T 7023.40D516Y（F）G/T GCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATG 7925.20 G 8238.20 T 8267.20D516GV（R）A/G/T CGACAGCGGGTTGTTCTGG 5875.80 A 6217.80 G 6148.80 T 6172.80H526D
31、YN（F）C/G/T/A ACCCGCTGTCGGGGTTGACC 6110.00 C 6383.00 G 6423.00 T 6452.00 A 6407.00H526LR（R）A/T/G GCCGACAGTCGGCGCTTG 5516.60 A 5858.60 T 5813.60 G 5789.60H531LW C/T/G GACCCACAAGCGCCGACTGT 6072.00 C 6345.00 T 6414.00 G 6385.00katG S315TN G/C/A TGTTCGTCCATACGACCTCGATGC 7279.80 G 7552.80 C 7592.80 A 7621
32、.80inhA 15 C/T GCATGGGTATGGGCCACTGACA 6800.40 C 7073.40 T 7142.4embB M306V（F）A/G GTCGGACGACGGCTACATCCTGGGC 7684.00 A 7981.00 G 7997.0M306I（R）G/C/A/T GGACGACGGCTACATCCTGGGCAT 7378.80 G 7691.80 C 7651.80 A 7675.80 T 7720.80Y319SC A/C/G CCACGCCGGCTACATGTCCAACT 6929.60 A 7226.60 C 7202.60 G 7242.60G406D
33、（R）G/A CCAGCGAGCCGAGCGCGATGATG 7099.60 G 7372.60 A 7441.60G406S（F）G/A CAACGGCCTGCGGCCGGAG 5839.80 G 6152.80 A 6136.80pncA Q10P A/C GCGAGCCACCCTCGCAGAAGTCGTTC 7917.20 A 8259.2 C 8230.20H57D C/G GGAATAGTCCGGTGTGCCGGAGAAGT 8116.20 C 8429.20 G 8389.20T76P A/C TGGGATGGAAGTCCGCGCCGGGAG 7499.80 A 7841.80 C
34、 7812.80588 疾病监测2023 年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.org DOI:10.3784/jbjc.202303160107行 准 确 性 验 证，全 基 因 组 测 序 作 为 耐 药 性 检 测 参 比方法；采用7种呼吸道病原（5株副流感病毒、5株甲型H1流感病毒、7株甲型H3流感病毒、1株轮状病毒、2株冠状病毒、20株其他呼吸道病毒、10株肺炎支原体）共50例咽拭子样本进行特异性验证。1.6统 计 学 分 析 应用SPSS20.0软 件 进 行 数 据 分析。计 数 资 料 以
35、 相 对 数 表 示，以 全 基 因 组 测 序 结 果为 本 实 验 的“金 标 准”，计算MALDI-TOFMS检 测MTB耐 药 性 的 灵 敏 度、特 异 度 及 正 确 率。灵 敏 度 计 算方法为真阳性数/（真阳性数假阴性数）100.00%；特 异 度 计 算 方 法 为 真 阴 性 数/（真 阴 性 数 假 阳 性数）100.00%。采用Kappa检 验 进 行 一 致 性 分 析，以 Kappa值 0.40为 一 致 性 较 差，Kappa值 为0.400.75为一致性中等，Kappa值0.75为一致性较高。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1结 核 分 枝 杆 菌 耐
36、 药 检 测 技 术 构 建 及 优 化 通 过5重PCR对5个 耐 药 基 因 进 行 扩 增，包括16个 突变 位 点，26种 突 变 型。16个 突 变 位 点 的 原 始 质 量 探针 延 伸（MPE）峰 值 见图1A、1B，MTB耐 药 菌 株 基因 突 变 位 点 MPE峰 值 及 延 伸 碱 基 如 图 1C 1L（质 量 误 差 小于500ppm）。经 过 优 化，16种MPE的最 终 浓 度 分 别为rpoBH526LR（R）（0.80mol/L）、embBG406S（F）（0.85mol/L）、rpoBH526DYN（F）（0.90 mol/L）、rpoBQ513PL（0.
37、99 mol/L）、embBY319SC（1.02 mol/L）、embBG406D（R）（1.05mol/L）、katGS315TN（1.07mol/L）、pncAT76P（1.10 mol/L）、rpoBD516Y（F）（1.16 mol/L）、pncAH57D（1.18 mol/L）、embBM306I（R）（0.75mol/L）、embBM306V（F）（0.79 mol/L）、fabG-inhA（0.82 mol/L）、rpoBD516GV（R）（0.86mol/L）、rpoBH531LW（0.89 mol/L）、pncAQ10P（1.16mol/L）。2.2临床样本准确性验证对40
38、例样本进行全基因组 测 序，将 测 序 结 果 与 质 谱 检 测 结 果 所 包 含 位 点 进行 比 对，判 断 是 否 具 有 一 致 性。40例MTB临 床 分离 株 中有3例 样 本 未 检 测到MTB耐 药 相 关 基 因，29例 样 本 检 测到MTB对RIF耐 药 相 关 基 因，30例样 本 检 测到MTB对INH耐 药 相 关 基 因，19例 样 本检测到MTB对EMB耐药相关基因，40例样本均未检 测到MTB对PZA耐 药 相 关 基 因，16例 样 本 同 时检 测到MTB对RIF、INH、EMB3种 药 物 的 耐 药 相关基因。以 全 基 因 测 序 结 果 为“金
39、 标 准”，本 研 究 构 建 的方 法 检 测 MTB对 RIF耐 药 突 变 的 灵 敏 度 为100.00%（29/29）、特 异 度 为 100.00%（11/11）；对INH的 耐 药 突 变 灵 敏 度为100.00%（30/30）、特 异 度为100.00%（10/10）；对EMB的 耐 药 突 变 灵 敏 度 为100.00%（19/19）、特 异 性 度 100.00%（21/21）；对PZA的 耐 药 突 变 特 异 性度100.00%（40/40），两 种 方法 检 测 一 致 率为100.00%，一 致 性 检验Kappa值 为1。质谱检测结果见表4，全基因组测序结果见
40、表5。2.3检 测 方 法 特 异 性 验 证 采 用 本 研 究 构 建 的 方 法对 包括7种 呼 吸 道 病 原 体的50例 咽 拭 子 样 本 均 未检测到质量探针延伸信号，特异性为100.00%。3讨论MTB耐药机制复杂，其主要原因与基因突变相关，RIF在 治 疗 过 程 中 广 泛 使 用，通 过 作 用 于 编 码RNA聚 合酶亚 单 位的rpoB基 因 发 挥 作 用，因 此95.00%以 上 的 RIF耐 药 与rpoB基 因 相 关 21 22。INH对 生 长 中 的 细 菌 有 活 性，其 耐 药 性 与katG、inhA基 因 突 变 有 关 7，23。EMB药 物
41、可 以 抑 制 阿 拉伯 糖 基 转 移 酶 并 破 坏 细 胞 壁 中 阿 拉 伯 半 乳 糖 的 生 物合 成，其 耐 药 性与embB、embA基 因 突 变 相 关 24。PZA作为前药在酸性条件下（pH5.5）具有毒性，需要由pncA基 因 编 码 的 吡 嗪 酰 胺 酶 转 化 为 其 活 性形 式 的 吡 嗪 酸，因 此，其 耐 药 性与pncA基 因 的 突 变相关2526。本 研 究 基 于 多重PCR-质 谱 微 测 序 技 术 构 建 了MTB耐 药 检 测 体 系，可 同 时 完 成对4种 一 线 治 疗 药物 的 耐 药 性 检 测（RIF、INH、EMB和PZA），
42、实 现 了16个 常 见 突 变 位 点、26种 突 变 型 同 时 检 测。由 于PZA的 表 型 药 敏 实 验 需 要 在 酸 性 条 件 下 进 行，与 其他药物的药敏实验所用条件、方法不一致，因此本实验 以 全 基 因 测 序 结 果 为“金 标 准”，本 研 究 构 建 的 方法 对 测 试 样 本 的 检 测 结 果 与 金 标 准 完 全 一 致，且 相比 金 标 准 测 序，本 研 究 构 建 的 核 酸 质 谱 检 测 更 加 快速 且 操 作 简 便。目 前 只 有 美 国的Agena公 司 推 出 了较 为 成 熟 的 核 酸 质 谱 系 统，余 艳 芳 等27人 使
43、用 美 国Agean公 司 的 MassARRAY质 谱 仪 系 统 进 行 了MTB对INH、氟 喹 诺 酮 类（左 氧 氟 沙 星、莫 西 沙 星）以 及 二 线 类 注 射 药 物（AMK、CPR）的 耐 药 性 分 析，与 一 代 测 序 结 果 相 比，两 种 方 法 一 致 率为100.00%，在技术准确性方面与本研究一致。与 常 用 耐 药 检 测 技 术 相 比，线 性 探 针 技 术、基因 芯 片、GeneXpert MTB/RIF和 Xpert MTB/RIFultra技 术 通 过 针 对 一 个 或 几 个 耐 药 基 因 来 确 定 其 耐药性，单次检测的突变数量有限
44、，若待测突变位点不在 某 一 段 区 域 集 中 出 现 时，则 须 使 用 多 套 引 物 进 行不 同 区 域 的 扩 增，且 因 扩 增 不 能 在 同 一 体 系 中 完 成疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5 589www.jbjc.org DOI:10.3784/jbjc.202303160107而 使 工 作 量 成 倍 增 加，而 质 谱 技 术 可 在 一 个 靶 点 同时 检 测 多达40种 突 变 20；全 基 因 组 测 序 技 术 可 得到完整的序列信息，但对仪器设备、实验室环境
45、等硬件 条 件 及 人 员 操 作 等 软 件 条 件 要 求 很 高，从 标 本 建库 到 最 后 序 列 拼 接 至 少 需要48h，且 检 测 成 本 高 昂，因 此 更 适 用 于 部 分 关 键 标 本 的 分 析，在 常 规 检 测 中使 用 受 限；本 研 究 构 建 的 技 术 可在7h内 完成96个核酸样本的检测，操作简单，完成一次单样本多位点注：A、B.MPE探针原始峰值；CL.MPE探针突变位点延伸结果；M、N.空白对照图1结核分枝杆菌突变位点的原始质量探针延伸质谱图Figure1Originalmassprobeextensionmassspectrometryofth
46、emutantsiteof Mycobacteriumtuberculosis590 疾病监测2023 年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.org DOI:10.3784/jbjc.202303160107表4 研究所用结核分枝杆菌核酸样本验证结果Table4Verificationresultsofnucleicacidsamplesfrom Mycobacteriumtuberculosis usedinthisresearch样本编号突变位点MPE延伸利福平 异烟肼 乙胺丁醇 吡嗪酰胺rpoBH5
47、26LRrpoBH526DYNrpoBQ513PLrpoBD516GV（R）rpoBH531LWrpoBD516Y（F）katGS315TNfabG-inhAembBY319SCembBG406D（R）embBM306I（R）embBM306V（F）embBG406SpncAT76PpncAH57DpncAQ10PMTB-01 A C A A C G G C A G G A G A C AMTB-02 A C A A C G Aa C A G G A G A C AMTB-03 A C A A C G Aa C A G G A G A C AMTB-04 A C A A C G Aa C A
48、G G A G A C AMTB-05 A C Ta A C G G C A G G A G A C AMTB-06 A Ga A A C G G Ta A G G A G A C AMTB-07 A C A A C Ta Ca C A G G A G A C AMTB-08 A C A A C G G C A G G A G A C AMTB-09 A Ta A A C G Ca C A G G A G A C AMTB-10 A C A A C Ta Ca C A G G A G A C AMTB-11 A C A A C G G C A G G A G A C AMTB-12 A C A
49、 A C G G Ta A G G A G A C AMTB-13 A C A A Ta G Ca C A G G A Aa A C AMTB-14 A C A A C G Ca C A G G Ga G A C AMTB-15 A C A A C G Ca C A G G Ga G A C AMTB-16 A C A A Ta G G C Ga G G A G A C AMTB-17 A C A A Ta G G Ta A G G A G A C AMTB-18 A C A A Ta G Ca C A G Ca A G A C AMTB-19 A C A A Ta G G Ta A Aa G
50、 A G A C AMTB-20 A C A A Ta G Ca C A G Ca A G A C AMTB-21 A C A Ta C G G Ta A Aa G A G A C AMTB-22 A C A A C G G Ta A G G A G A C AMTB-23 A Ta A A C G Ca C A G G A G A C AMTB-24 A C A A Ga G Aa C A G G A G A C AMTB-25 A Aa A A C G G C A G G A G A C AMTB-26 A C A A C G G C A G G A G A C AMTB-27 A Ta
