1、第二章 基因工程的工具酶第一节 用于基因工程的工具酶一、限制性内切酶（Endonucleosase）（一）限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类1） 50 年代初发现细菌能将外来 DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体 DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： hsd R-限制性内切酶 hsd M-限制性甲基化酶 hsd S-控制两个系统的表达 1968 年 Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个
2、类内切酶，Hind II 和 Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出 400余种 II类酶，搞清识别位点的有 300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种 。2）限制性核酸内切酶可分为三大类： I 类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。II 类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 III 类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。因此在基因工程中具有实用价值的是 II类限制性内切酶。 （二）II 类限制性内切酶的命名及特性 命名原则：取属名的第一个字母大写，取
3、种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号 I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。如，HindIII 从 Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性 R质粒上。（三）II 类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 绝大多数的 II类限制性内切酶在底物 DNA上的识别顺序长度为 4，5，6 碱基对，这些碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），而且切点就在其内部，如 EcoRI 5-GAATTC
4、-3 。DNA 被限制性内切酶切开之后，呈现两种断口：钝端（平端）如 Pvu II, Alu I, EcoR V等粘端（粘性末端）如：EcoR I 等图 2-1 限制性内切酶产生的末端（四）识别位点在 DNA分子中的频率对于特定的限制性酶在 DNA分子中的识别位点数目是可以计算的，四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约 4096（46）个核苷酸有一个识别序列，计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的。实践中这种方法不完全正确，如 DNA 长49kb，对于六碱基的酶应该有 12个切割位点，实际上要少一些，如 Bgl II只有 6个，BamHI只有 5个，而 S
5、alI只有 2个。二、甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。（一）大肠杆菌中的甲基化酶 dam 甲基化酶: 可在 5GATC3序列中的腺嘌呤 N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有 5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的 DNA如 Bcl I（TGATCA），但 BamH I（GGATAA）则不会因为 N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 dcm 甲基化酶 此酶在序列 5CCAGG3或 5CCTGG3中的胞嘧啶 C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是 EcoR II。 （二） 甲基化酶在基因工程中用途许多 II类限制性内切酶，都存在着相对
6、的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI 催化 s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到 EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使 DNA免受 EcoRI的切割。三、T4-DNA 连接酶（T4-DNA Ligase）来源于 T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复 3端羟基和 5端磷酸基因，脱水形成 3-5磷酸二酯键连接双链 DNA上的单链缺口（Nick），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 连接 RNA模板上的 DNA链缺口连接平头双链 DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，这属于分子之间的连接.图 2-2
7、 连接酶的作用方式四、核酸酶作用: 降解磷酸二酯键分为：外切酶 内切酶（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性。依赖于 Ca2+用途：构建限制酶图谱产生末端缺失突变DNA 超螺旋线性化（二）E. coli 外切酶 III只降解 DNA分子的一条链，产生单链的 DNA分子。（三）S1 核酸酶（来源于米曲霉菌）特性：1. 降解单链 DNA或 RNA，降解 DNA的速度大于降解的速度2. 降解发生的方式为内切和外切3. 酶切活性需 4.0-4.5pH环境，Zn2+激活4. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性
8、比单链低 75000倍（四） DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链五、聚合酶（一）DNA 聚合酶 I5-3聚合酶活性3-5外切酶活性5-3外切酶活性核酸内切酶活性可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow 片段和 N端具 5-3外切酶活性的分子。图 2-3 DNA聚合酶 I（二） Klenow 酶该酶无 5-3外切活性，保留了 5-3聚合活性及 3-5外切活性，基因工程中利用该酶：修复限制性内切酶造成的 5突出的粘性末端标记 DNA探针催化 cDNA第二条链的合成末端终止法测序图 2-4 Klenow 酶的作用方式（三） T4 DNA 聚
9、合酶与 Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。（四）T7 DNA 聚合酶测序酶（五） Taq DNA 聚合酶耐高温，主要用于 PCR反应。（六） 逆转录酶：将 mRNA转录成 cDNAAMV 逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）DNA 聚合酶活性RNase H 活性DNA 内切酶活性核酸结合活性M-MLV 逆转录酶（Moloney 鼠白血病病毒）两种逆转录酶的区别肽链的组成禽酶 2条肽链，具聚合酶和很强的 RNase H活性鼠酶 1条，较弱的 RNase H活性反应的最适温度禽酶 42C，二级结构丰富 RNA，禽酶效率高反应的最适 pH值禽酶 pH 8.3鼠酶 pH 7.
10、6六、DNA 修饰酶有大量的修饰酶，主要的有以下几种：1） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉 DNA分子的 5端的磷酸基团。2） polynucleotide kinase: 来自于 T4侵染的大肠杆菌，在 5端增加磷酸基团。3） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在 DNA分子的 3端增加一个或多个脱氧核苷酸。4） Topoisomerase 改变共价闭合双链 DNA分子的结构第二节 DNA 的切割反应一、缓冲系统的组成II 类酶的酶活条件：Tris-HCl PH7.5, 25-50mM；10
11、mM MgCl2 ；NaCl 0-150mM； DTT 1mM 根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下三种情况：高盐：100-150mM 中盐：50-100mM低盐：0-50mM 二、酶切操作DNA 量的确定，加入酶量的确定，发应体积的确定（20l），反应时间的确定，1-1.5hr，一般为 37，但也有例外，如 Taq I在 65C时活性最高。单位限制性内切酶定义为：在最佳缓冲系统和 20l 体积中反应 1小时，完全水解1gDNA 所需的酶量。三、酶切结果分析（一） 酶切片段的检测1） 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离
12、 1-300bp的分子。2） DNA 分子的检测 a. 染色 EB，DNA 分子小于 25ng，很难检测到b. 放射性自显影, 可以监测少到 2ng DNA分子。（二）估计 DNA分子的大小根据 DNA分子的迁移率，可以用公式计算出分子量 D=a-b(logM)D是移动的距离，M 是分子量，a, b 是恒量但随着电泳条件的改变而改变。也可以根据已知大小的片段进行比较，误差约在 5%左右。四、多酶联合酶解对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解；对于对浓度要求不同的酶，可以：1. 低盐浓度的酶先切，后补加 NaCL2. 一种酶切后，换缓冲液，加 5mM NaAc 0.1体积，2 体积乙醇，冰浴
13、 5min，4离心10min，干燥五、定位酶切位点建立酶切图谱需要一系列的酶。首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目；然后进行双酶切；比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱；含糊的位点可以通过部分酶切解决，可以短时间的酶切或者在 4C条件下进行。六、 限制性内切酶的 star活性在 PH不合适，或甘油浓度过高10%时，限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。第三节 DNA 片段的连接重组 DNA分子构建的最后一步是连接，通过连接酶完成。相对而言，钝端的连接效率较低，因此一般提高 DNA浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高，因为两个粘性末
14、端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种：一、连接方式（一）相同粘性末端的连接来源:相同的酶同尾酶问题:极性有两种可能 同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。 （二）平头末端的连接粘性末端-分子内部连接，平头末端-分子间的连接。提高连接效率的方法： 加大酶用量（10 倍） 加大平头末端底物的浓度加入 10%PEG（8000），促进分子间的有效作用 加入单价阳离子， 150-200mM NaCl提高反应温度平头连接同样存在两种极性 （三）不同粘性末端的连接突出 5末端Klenow 补平，或 S1核酸酶切平，然后平头连接
15、突出 3末端T4-DNApol 切平，然后平头连接突出末端不同 Klenow 补平，或 S1核酸酶切平 连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI 与 HindIII（ XbaI 恢复）， XbaI 与 EcoRI（均保留），BamHI 与 Bgl II（产生 ClaI位点）（四）人工粘性末端的连接5突出的末端 外源片段先用 Klenow补平；然后用 TdT补加 polyC；载体片段也用 Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 3突出的末端 外源片段先用 TdT加 polyG；载体片段加 polyC；然后退火；再用 Klenow补
16、齐；连接 平头末端 可直接用 TdT补加末端，但以加 polyA/T为佳。这样稍微加热，AT 区就会出现单链区域，然后用 S1核酸酶水解即可回收片段 （五）粘端与平端的连接linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链 DNA片段。 连接的效率较高 酶切时可能破坏 DNA分子的完整。adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。图 2-5 linker 的连接方式（六）粘性末端的更换在 DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 BamHI 酶切片段用 Klenow补平，或用 S1酶切平；连接一段 linker或 Adaptor，使之产生 EcoRI粘性末端。这样 BamHI切口就换成了 EcoRI切口 。 由 AluI更换 EcoRI：AluI 切开，T4-DNApol 切平，另一段 DNA EcoRI切开，Klenow补平，连接，原来含有 AluI的片段变成含有 EcoRI 二、重组率重组率：连接反应结束后，含有外源 DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为 25-75% 提高重组率的方法： 连接反应条件 外源片段：载体2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。 载体除磷 （磷酸酯酶 5除磷）。TdT 在 3端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 。
