1、大穗黑麦草成熟种子愈伤组织诱导及分化的研究2004 年第 12 期大穗黑麦草成熟种子愈伤组织诱导及分化的研究余泽高,黄喜梅(长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025)摘要:以大穗黑麦草成熟种子为外植体,采用 MS 基本培养基 ,研究了不同浓度的 2,4一 D 和 6一BA 及其组合对其愈伤组织诱导的影响,不同浓度的 NAA 和 6 一 BA 组合对愈伤组织分化成苗的影响.结果表明:不同浓度 2,4 一 D 对大穗黑麦草愈伤组织诱导率差异显着,以 7mg/L效果最好.浓度过高,愈伤组织诱导率下降;在 01.0mg/L 范围内,6 一 BA 浓度越高,愈伤组织诱导率越高.但长势渐差;2,4 一
2、 D+6 一 BA 的不同配比浓度的愈伤组织诱导率存在差异,以MS+7mg/L2.4 一 D+0mg/L6 一 BA 的组合为最优,产生的愈伤组织数量多,质量好;NAA+6 一 BA 不同配比浓度的愈伤组织分化率存在一定差异,以 MS+NAA0.5mg/L+6一 BA1mg/L 的愈伤组织分化率最高.初步建立了一个以大穗黑麦草成熟种子为外植体的愈伤组织诱导及分化体系.关键词:大穗黑麦草;成熟种子;2,4 一 D;6 一 BA;愈伤组织 ;分化中图分类号:$519 文献标识码:A 文章编号:10043268(2004)12000704StudiesonCallusInductionandDiff
3、erentiationofMatureSeedofLoliumgrandispicumY.J.FeiYUZegao.HUANGXimei(LifeScienceCollege,YangtzeUniversity,Jingzhou434025,China)Abstract:TakingthematureseedofLoliumgrandspicumY?J?FeiasexplantandadoptingMSbasalmedium.theinfluenceoncallusinducingbydifferentconcd.of2,4 一 D,6 一BAandtheircombination.aswel
4、lastheinfluenceoncallusdifferentiationbyNAAand6 一BAcombinationwerestudied.Theresultsshowedthatdifferentconcd.2.4 一Dhavesignificantvariationoncallusinducingratioandtheconcd.of7mg/LiSmosteffective.Whilewiththeincreaseofconcd.thecallusinducingratiodecrease.In01.0mg/L,thehigherthe6 一 BAconcd.is,thehighe
5、rthecallusinducingratioiS.buttheweakerthegrowthiS.Differentconcd.of2,4 一 D+6 一BAcombinationhavevariationoncallusinducingandthecombinationofMS+7mg/L2.4 一D+0mg/L6一BAiStheoptimum.whichproducemostcalluswithhighquality.Differentconcd.ofNAA+6一BAcombinationhavevariationoncallusdifferentiation.withthehighes
6、tdifferentiationonMS+NAA0.5mg/L+6 一BA1mg/L.AcallusinducinganddifferentiationsystemisestablishedbytakingthematureseedofLoliumgrandispicumY?J?Feiasexplant.Keywords:LoliumgrandispicumY?J?Fei:Matureseed;2,4 一 D;6 一BA;Callus;Differentiation大穗黑麦草(LoliumgrandispicumY?J?Fei)属湖北黑麦草属(禾本科) 一新种,于 1998 年 6 月在湖北荆
7、州市东郊发现.为多年生草本,丛生,穗大.通过与普通小麦品种鄂恩 1 号及鄂恩 4 号比较研究发现,其生育期与普通小麦相近,具有很强的抗病性和抗衰老性 2l.大穗黑麦草由于发现时间短.人们对它的研究还处于初步阶段,但作为一个野生新种的优良性状已经表现出来.本研究旨在建立以大穗黑麦草成熟种子为外植体的愈伤组织诱导及再生体系.为其进一步研究做准备,收稿 El 期:20040819基金项目:湖北省“九五“ 重大科技计划项目(962P0503)作者简介:余泽高(1946 一),男,湖北石首人.教授,主要从事细胞工程学教学和科研工作.?7?河南农业科学同时为其在小麦或其他禾本科作物通过细胞工程和基因工程进
8、行遗传改良提供依据.1 材料与方法1.1 供试材料及处理供试大穗黑麦草成熟种子由本校小麦育种组提供.取大穗黑麦草种子,在 50%的硫酸中浸泡,脱去颖壳后用清水洗净,去掉杂质,再用清水浸泡 12h,然后用清水冲洗后置于 4冰箱内备用.1.2 试验万法1.2.1 培养基配制以 MS 为基本培养基,依据各种组合附加不同种类及浓度的激素,其中琼脂 0.8%,蔗糖 3%,用 1.0mol/L 的 NaOH 和HCI 调节 pH 值至 5.8,然后在 121126下高压灭菌 20min,移于接种室备用.(1)愈伤组织诱导培养基 MS+2,4 一 D(0,1,3,5,7,9mg/L)+6 一 BA(0,0.
9、1,1.0mg/L)组成 18 种不同 2,4 一 D 浓度和 6 一 BA 浓度组合的愈伤组织诱导培养基(表 1).表 1 不同愈伤组织诱导培养基项目诱导培养基组合2,4 一 D(mg/L)0135790135790135796 一 BA(mg/L)0000000.10.10.10.10.10.10.11.01.01.01.01.0(2)分化培养基 MS+6 一 BA(1,3,5mg/I)+NAA(0.1,0.5,1.0mg/L)组成 9 种不同的 6 一BA 浓度和 NAA 浓度组合的分化培养基,其组合如表 2.表 2 不同愈伤组织分化培养基项目分化培养基组合6 一 BA(m_g/L)NA
10、A(mg/L)1O.15O.15O.551.O1.2.2 种子消毒与接种挑选大穗黑麦草饱满种子用 70%乙醇进行表面消毒 1min,然后用0.1%HgCI 溶液进一步消毒 8min,期间不停振荡,最后用无菌水清洗 5 次.在操作工作台上无菌操作,每种处理组合的愈伤组织诱导培养瓶中接种 50 粒种子,8 次重复.1.2.3 愈伤组织诱导(1)培养条件组织培养室温度(251) ,暗培养.(2)形态观察, 数据记载培养 4d 后,每天观察并记录出愈情况,包括愈伤组织生长速度,数目,形态特征,大小,颜色变化等,20d 统计愈伤组织数,并进行实物照像.1.2.4 分化培养 20d,将愈伤组织在无菌条件下
11、切成 34mm 的小块,转至分化培养基中,在(251)培养室 ,光强 2000Ix,光照时间12h/d 培养.逐日观察分化情况,25d 统计分化率,并对实物照像.1.2.5 数据处理通过统计愈伤组织数,计算出?8?愈伤组织出愈率,出愈率:愈伤组织数/接种大穗黑麦草种子数100%,然后将数据经反正弦转换(Sin 一 1/P)后进行方差分析和多重比较 H.5J,统计处理在 PC 机上采用 SAS6.12 统计分析软件完成.愈伤组织的分化情况,采用愈伤组织在各种激素浓度配比分化培养基中的分化率进行比较.愈伤组织分化率:有芽形成的愈伤组织数/接种的愈伤组织数100%J.2 结果与分析2.1 愈伤组织的
12、诱导种子接种 4d,在有 2,413 的培养基中,绝大部分种子长出芽和细根,在芽鞘和种子连接处产生一种白色水浸状,柔软松散的愈伤组织,极少部分种子出现一种白色不透明,致密的颗粒物质,极少部分未出芽或长根的种子一直保持吸水状态.连续 20d 观察,水浸状,柔软的愈伤组织生长较快,并保持松散状态,颜色由白色透明转变为半透明淡黄色,而致密的颗粒状物质生长缓慢,颜色转变为暗绿色(图 1-4).2004 年第 12 期j图 14 大穗黑麦草成熟种子愈伤组织的诱导通过统计不同培养基中愈伤组织出现的数目,计算出愈伤组织产生的百分率,数据经转换后进行方差分析.方差分析表明,2,4 一 D 之间,6 一BA 之
13、间以及 2 种激素间的差异都达到极显着水平.2.4 一 D 不同浓度处理的差异显着性测验表明(表 3),2,4 一 D 的 6 种浓度间 ,按出愈率从高度到低的顺序.7mg/L 比 5mg/L 高 1.0 个百分点,差异不显着,7mg/L 比 9mg/L 高 5.5 个百分点,差异达显着水平;7mg/L 分别比 3rag/L,1mg/L 和 0mg/L 高 9.4.72.1 和 95.5 个百分点,差异达极显着水平;5mg/L 比 9mg/L 高 4.5个百分点,未达显着水平,5mg/L 比 3rag/L,1mg/L,0mg/L 分别高 9.4.71.1 和 94.5 个百分点,差异达极显着水
14、平;9rag/L 比 3mg/L 高3.9 个百分点,差异未达显着水平,9rag/L 比1mg/L 和 0mg/L 分别高 66.7 和 90.0 个百分点,差异达极显着水平;3mg/L 比 1mg/L 和 0mg/L分别高 62.4 和 86.1 个百分点.差异达极显着水平;1mg/L 比 0mg/L 高 23.4 个百分点,差异达极显着水平.其中 2,4 一 D7mg/L 对愈伤组织诱导的效果最好.表 32,4 一 D 各处理出愈率差异显着性测验6 一 BA 浓度的差异显着性测验表明(表 4),在 01mg/L,6 一 BA 的浓度越高其愈伤组织诱导率越高.1mg/L 比 0.1mg/L
15、和 0mg/L 出愈率分别高 9.8 和 14.1 个百分点,差异达极显着水平,0.1mg/L 比 0mg/L 高 4.3 个百分点,差异不显着.经对生长势观察发现,随着 6 一 BA 浓度的升高.愈伤组织的生长势变差.表 46 一 BA 各处理出愈率差异显着性测验不同激素处理组合的差异显着性测验表明(表5),2,4 一 D+6 一 BA 不同浓度配比对愈伤组织的诱导存在一定差异.其中以 MS+2,4 一 D7mg/L+6一BA0mg/L 培养基诱导出的愈伤组织最多.表 52.4 一 D 与 6 一 BA 不同浓度组合出愈率差异显着性测验2.2 愈伤组织的分化对大穗黑麦草成熟种子.将在诱导培养
16、基为MS+2.4 一 D7mg/L+6 一 BA0mg/L 生长良好的愈伤组织转到分化培养基中进行分化培养,3d即开始分化出绿色芽点.随即由绿色芽点分化形?9?河南农业科学成不定芽并生根(图 5-8),25d 统计分化率.结果列于表 6.图 58 大穗黑麦草成熟种子愈伤组织的芽苗分化表 6NAb.+6 一 BA 不同浓度组合下愈伤组织分化率(%)表 6 结果表明,MS+NAA0.5mg/L+6 一BA1mg/L 时,愈伤组织芽苗分化率达 57.7%,为最高,其次是 MS+NAA0.5mg/L+6 一 BA3mg/L 时的分化率,为 43.3%.分化率最低的是MS+NAA0.5mg/L+6 一
17、BA5mg/L 组合,其分化率只有 16.7%.3 小结与讨论植物生长素 2,4 一 D 对大穗黑麦草成熟种子愈伤组织的诱导率有明显的促进作用.本研究表明,在 07mg/L 浓度范围内.随着 2,4 一 D 浓度的增加,愈伤组织的诱导率升高,但 2,4 一 D 浓度高到一定程度(2,4 一 D 浓度为 9mg/L)后,出愈率呈下降趋势,这与何阳鹏等,】关于 2,4 一 D对高羊茅等成熟种子愈伤组织诱导的影响报道基本吻合;6 一 BA 浓度在 O 一 1.0mg/L,其浓度增加?1O?时,愈伤组织的诱导率有升高的趋势,这与徐定炎等,】的研究结果不尽一致;但柳建军等9 的研究表明,同属禾本科的小麦
18、成熟胚 6 一 BA1.0mg/L 时愈伤组织的诱导率高于 0.5mg/L,这可能与植物种类及其基因型不同有关,值得进一步探讨.研究中发现,6 一 BA 浓度增加到 1mg/L时,虽然愈伤组织诱导率升高,但长势却变差,愈伤组织不透明,发白,硬实,生长缓慢,最后转变为暗黄色.利用价值低,而诱导率最高的组合仍为 6一BA 浓度为 0 的组合,且愈伤组织长势良好.对于大穗黑麦草成熟种子愈伤组织的诱导,2,4 一 D 与 6 一 BA 浓度配比间存在明显的互作关系.低浓度的 6 一 BA 与适当浓度的 2,4 一 D 组合.可以提高出愈率.当培养基中的 2,4 一 D 的浓度为 7mg/L.6 一 B
19、A 浓度为 0mg/L 时,愈伤组织的诱导率最高,且质量最好,6 一 BA 浓度增高时,在较高 2.4 一 D 浓度下,愈伤组织的诱导率才会较高.但质量差.本研究表明,培养基为 MS+NAA0.5mg/L+6 一 BA1mg/L 时分化率较高,达 57.7%.江巨鳌等1o研究指出 ,不同高羊茅品种间愈伤组织的分化适宜 6 一 BA 的浓度不同.有的品种当 6 一BA 浓度为 2mg/L 时.愈伤组织的分化率高,有的品种则当 6 一 BA 浓度为 3mg/L 时,愈伤组织的分化率高.为了进一步提高其分化率.应选用多种植物生长素和植物细胞分裂素浓度配比及其添加其他生物活性物质.以提高其分化率.参考
20、文献:1费永俊.湖北黑麦草属 (禾本科) 一新种J.广西植物,1999,19(3):205206.2余泽高.沈健 .大穗黑麦草生物学性状及生理生化特性的研究J.河南农业科学.2003(2):46.3周维燕.植物细胞工程原理与技术M.北京:中国农业大学出版社.2001.243251.4何阳鹏,于海涛 .不同种胚及激素处理对高羊茅愈伤组织诱导的影响J.安徽农业科学,2003,31(3):371374.5盖钧镒.试验统计方法 M.北京:中国农业出版社,2000.118127.371395.6张万军,王涛 .多年生黑麦草组织培养与植株再生研究【】.草地,2003,11(3):219 222.7徐定炎,何阳鹏 .不同激素浓度在暗培养条件下对多年生黑麦草愈伤组织诱导的影响J.浙江林业科技,2003,23(2):1619.8陈智勇,杨自力 .提高高羊茅愈伤组织诱导率的因素J. 草业 ,2003,12(4):6971.9柳建军.于红欣 ,冯兆礼.小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化的研究J.山东农业大学,2003,31(3)237374.1O江巨鳌,赵运林 ,陈智勇 ,等.高羊茅愈伤组织再生系统的建立J.湖南农业大学(自然科学版).2003.29(5):385387.
