1、凡纳滨对虾类 Ig 定性和定位的初步研究凡纳滨对虾类 Ig 定性和定位的初步研究章跃陵,刘文杰,王三英,黄通旺研究报告 R 熙耍(1_厦门大学生命科学学院,福建厦门 361005;2.汕头大学理学院生物学系 ,广东汕头 515063)摘要:以凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)为研究对象 ,运用 Westernblotting 和免疫组织化学等现代免疫学方法,对对虾中的类 Ig(immunoglobulin,免疫球蛋白)蛋白进行定性和定位研究.结果发现,虾血清中有两种分子质量约为 7Oku 和 62ku 的蛋白可与抗人Ig 发生特异性的结合.同时,虾血细胞无颗粒细胞的外膜及虾类
2、淋巴器,肝胰脏,心脏,胃和肠等 5 种组织器官的石蜡切片与抗人 Ig 反应呈不同程度的阳性,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深.提示,虾体内确实存在能与抗人 Ig 发生特异性结合的类 Ig 蛋白,其不仅存在于虾血清中,还存在于无颗粒细胞,类淋巴器和肝胰脏等组织中,为对虾的免疫系统的研究和疾病的防治奠定基础.关键词:凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei);类 Ig 蛋白; 免疫特异性;组织定位中图分类号:S917.4 文献标识码:A 文章编号:i0003096(2005)090031 一 O5一般认为无脊椎动物体液中不具有免疫球蛋白,但近年来研究表明,无脊椎动物体内同样存在免疫球蛋白超家
3、族分子_1,甚至有类似于脊椎动物的适应性免疫反应的存在_6.关于虾内是否存在类Ig(Iglike)分子,国内外鲜有报道.叶淑芳 l,王雷,王伟庆 “和章跃陵等“分别采用免疫单向扩散法(SRID)和免疫酶斑点法(DotELISA)检测对虾体液中的类似物质.结果发现对虾血清中存在能与抗人 Ig 发生特异性结合的物质,提示对虾血清中有类 IgM,IgG 和 IgA 样物质的存在 .然而,此类物质是否存在于虾血清中,还存在不同的观点,更不消说对其的定性和定位的研究.因此,这些能与抗人血清发生反应的虾血清成分的本质有待于进一步研究.作者采用 SDS-PAGE,Western-blotting 和免疫组织
4、化学等现代生物学技术对其进行定性和定位的初步研究,为丰富虾类免疫系统研究,探索对虾疾病免疫学防治提供科学依据.1 材料与方法1.1 实验材料以凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)为实验材料,购于厦门大学菜市场,体长约 10cm.1.2 实验方法1.2.1 虾血清制备按王雷等的方法进行,用 1mL 注射器直接从对虾心脏抽取血淋巴,4冰箱过夜,3000r/min 离心 20min,一 20保存备用.l_2.2SDS-PAGE 电泳用 0.01mol/LpH7.4PBS 将虾血清按 1:1O稀释,与 2SDS 凝胶加样缓冲液等体积混合,100煮沸 5min,采用 3 浓缩胶,1O 分
5、离胶按常规方法进行.l_2.3Western-blotting 分析同上进行 SDS-PAGE 电泳 ,电泳结束后,恒压电转 6h,丽春红 S(PoneeauS)总蛋白显色,TBS 充分洗涤,5 脱脂奶粉 37封闭 1h,分别与羊抗人IgM,IgG 和 IgA 抗血清(1:50)室温孵育 3h,TBS洗涤 310min,兔抗羊 IgG-HRP(1:1000)37孵育 1h,TTBS 洗涤 310min,TBS 洗涤 35min,DAB 显色,GDS8000PC 一凝胶成像及分析系统扫描和分析.1.2.4 血细胞定位分析用 1mL 注射器直接从对虾心脏抽取血淋巴,涂于洁净载玻片上,置室温 5mi
6、n,TBS 洗涤 5min,甲收稿日期:200412-20;修回日期:20050328基金项目:国家“863“计划项目基金(2002AA629050);广东省自然基金博士启动基金(130122187)作者简介:章跃陵(1971 一),男,湖南桃江人,讲师,博士,现从事海洋分子免疫学研究,Email:zhangylxmurip.sina.C0mMarineSciences/V01.29.N0.9/200531研究报告 R醇浸泡 10S,自然晾干 ,TBS 洗涤 25rain,1H2O2 室温处理 20rain,TBS 洗涤 35min,1 奶粉37封闭 10min,用 TBS 代替第抗体为阴性对
7、照,羊抗人 IgG 抗血清(1:50)37孵育 4h,TBS洗涤 35min,兔抗羊 IgG-HRP(1:1000)37孵育 1h,TBS 洗涤 35rain,DAB 显色,OlympusBH 一 2 型显微镜观察并摄片.1.2.5 组织定位分析选体长约 10cm 的凡纳滨对虾,迅速取其新鲜组织(心脏 ,肝胰脏,胃,肠和类淋巴器),BouinS 液固定 18h,70 酒精充分冲洗,常规梯度酒精脱水,石蜡包埋,切 6,um 厚的连续切片.取相邻间断连续切片,常规复水,3HO.处理 30min,5 脱脂奶粉封闭 45min,以 TBS 代替第一抗体为阴性对照,用间接免疫组织化学法染色.所用抗体及稀
8、释度如下:第一抗体为羊抗人 IgG 抗血清(1:100),37孵育 3h,第二抗体为兔抗羊 IgG-HRP(i:i000),37孵育 1h.标本最后用 DAB 显色,常规脱水,透明,封固,用 OlympusBH 一 2 型显微镜观察并摄片.2 结果与分析2.13 种类 Ig(IgM,IgG 和 IgA)的定性分析采用 SDS-PAGE 和 Western-blotting 方法检测凡纳滨对虾血清中的类 Ig 物质,结果如图 1 所示,虾血清与羊抗人 IgM,IgG 和 IgA 抗血清反应均呈阳性,其中表观分子质量为 7Oku 的阳性条带(命名为ILp70)分别与羊抗人 IgM,IgG 和 Ig
9、A3 种羊抗人 Ig特异性结合,而表观分子质量为 62ku 的阳性条带(命名为 ILp62)只与羊抗人 IgG 特异性结合.说明虾血清中确实存在与羊抗人 Ig 反应的类 Ig.21310ku爨囊20.1ku图 1 凡纳滨对虾血清的 SDS-PAGE 和 Westernblotting 分析Fig.1SDS-PAGEandWesternblottinganalysisofL.vannameiserum.1:分子质量标准;2:虾血清 SDS-PAGE 分析;3:0.57 氨基黑总蛋白染色;46:分别为虾血清与一抗为羊抗人 IgG(1:50),IgA(1:50)和 IgM(1:50)的 Wester
10、n-blotting 分析1:molecularmassmarkers;2:SDS-PAGEanalysisofshrimpserum;3:thestainingoftotalproteinsofshrimpserumwith0.57amidobiack;4-6:shrimpserumincubatedwithgoatanti+humanIgG(150)tIgA(1l50),lgM(Il5O)antiserumrespectivelyforWesternblottinganalysis2.2 类 Ig 血细胞定位分析以羊抗人 IgG 抗血清为一抗,检测类 IgG 在凡纳滨对虾血细胞中的分布.从
11、图 2 可知,部分血细胞的外膜有明显的阳性反应.参照光镜下对虾三种血细胞(无颗粒细胞,小颗粒细胞和大颗粒细胞)的形态特征,初步推断该阳性细胞应该为无颗粒细胞,它可能与凡纳滨对虾中的类 Ig 在血淋巴中的合成和分22图 2 凡纳滨对虾类 IgG 的血细胞免疫定位分析Fig.2ImmunolocalizationoftheIgGlikeproteininhemocytespecimenofL.vannamei.2-1:虾血细胞组织与一抗为羊抗人 ZgG(1t50)的免疫酶分析 (1680);22:虾血细胞组织与一抗为正常羊血清(1t50)的免疫酶分析(1680X)21:goatantihumanI
12、gG(150)reactedwithhemocytespecimen(1680X);22:normalgoatserum(1:50)reactedwithhemocytespecimen(1680).海洋科学/2005 年/第 29 卷/第 9 期泌有关.2.3 类 Ig 组织定位分析选取凡纳滨对虾类淋巴器,肝胰脏,心脏,胃和肠等 5 种组织器官为材料,以羊抗人 IgG 抗血清为一抗,采用免疫酶免疫组织化学法检测类 IgG 在对虾组织中的分布.结果表明(图 3),5 种组织器官的组织切片与羊抗人 IgG 抗血清反应均有不同程度的显色,其中类淋巴器和肝胰脏显色较深,而其它 3 种组织显色相对较浅
13、.类淋巴器,心脏和肝胰脏的显色部位主要集中在组织的胞间,胞质或胞核,而胃和肠主要集中在其表皮组织.由此说明,类 Ig 是对是体内的一种分布相当广泛的蛋白.32a-a/一一 _0.;+,.一?:.一?l.,Il-3.,3-6.一?.t0,0:.0图 3 凡纳滨对虾类 lgG 的石蜡切片定位分析Fig,3lmmunolocalizationofthelgG-likeproteininparaffinsectionofL,vannameitissues31:虾肝胰脏石蜡切片与一抗为羊抗人 IgG(1t100)的免疫酶分折(400);3-2虾肝胰脏石蜡切片与一抗为正常羊血清(1t100)的免疫酶分折(
14、400);3-3 3-6:分别为虾胃,肠,类淋巴器和心脏的石蜡切片与一抗为羊抗人 IgG(1100)的免疫酶分折,其放大倍数依次为:100.100.400和 40031goatanti-humanIgG(1l100)reactedwithhepatopancrea(400);3-2:normalgoatserum(1l100)reactedwithhepatopancreas(400)#3-336:goatanti-humanIgG(1;100)reactedwithstomach(100 ),intestine(100),lymphatic-likeorgan(400)andheart(40
15、0)respectively3 讨论研究表明,免疫球蛋白超家族(immunoglobulingenesuperfamily,IgSF)是一类数量庞大 ,功能多样的家族系统,它广泛分布在脊椎动物和无脊椎动物中,其一般是细胞表面结合分子,主要参与细胞与细胞之间的相互作用 ll.据初步推算,人,苍蝇和蚯蚓中分别约含有 765,140 和 64 个 IgSF 分子 0.然而,目前关于虾内是否存在类 Ig 分子学术界尚存在争论.本课题率先运用 Western-blottlng 和免疫组织化学等现代免疫学方法证实对虾体内确实存在能与抗人 Ig 发生特异性结合的类 Ig 分子,并发现其同样分布于对虾的血细胞
16、和组织中,对丰富和发展对虾免疫系统基础的研究,探索对虾疾病的免疫学防治具有重要意义.根据目前所掌握的资料分析,虾血清中可能存在类 Ig 样物质 ,但均未对其进行进一步的研究,也无确凿的证据加以证实“.作者在此基础之上 ,运用Western-blotting 检测对虾血清中的类 Ig,结果发现虾血清中的两种蛋白ILp7O 和 ILp62 与抗人 Ig抗血清呈明显的阳性反应(图 1),说明对虾体内确实存在与人 Ig 相类似的类 Ig 分子,其抗原位点可能与人 Ig 存在较大的同源性.目前,在一些无脊椎动物中人们发现了很多与人 Ig 高度同源的蛋白,如 Zenteno 等 ll.报道淡水虾 Macr
17、obrachiumrosenbergii 血淋巴中的唾液酸特异凝集素分别与人 Ig 和 Ig 具MarineSciences/vo1.29.No.9/200533,.,tt,.,莩.0 讪,.,.0,一.一,.研究报告 Ro:tUm有 22 和 27 的同源性.由此推测,作者所发现的 P4(hemolin)fromManducaSext:amemberofthe与抗人 Ig 抗血清发生特异性结合的 ILp70 和ILp62immunoglobulinsuperfamilywhichcaninhibithemo蛋白与人 Ig 在氨基酸序列上也应当存在一定的同源 cyteaggregationJ.ArchInsectBiochemPhysiol,性,其可能是存在于对虾血淋巴中的两种新的 IgSF1991,18:285-300.分子,至于其具体的氨基酸序列和基因结构还有待H.kRM,SmitAB,Fi“g.H,tal?AnewIgsu 一于通过质谱和基因克隆等分子生物学技术进行进一 h.mb“.“.“.“.步的研究和鉴定.MDM)froim0siLynJne.Esta,gnIalis,i.sl,d1o9w9n6-,re2g6u:a
