1、广州市郊鼠中检出埃立克体样微生物中国人兽共患病杂志ChineseJournalofZoonoses41文章编号:10022694(2003)05 004103广州市郊鼠中检出埃立克体样微生物*潘华一,刘世忠,马玉海,佟世德,孙洋摘要:目的了解曾经两次暴发犬埃立克体病流行的广州市郊某养犬基地野生啮齿动物感染埃立克体情况.方法用 16SrRNA 基因埃立克体属特异引物对抓捕的动物全血及脾脏样本进行 PCR检测,阳性样本克隆测序,所得序列与 GenBank 中注册的核苷酸序列进行比较.结果在所抓捕的 26 只野生啮齿动物中,3 份褐家鼠全血样本和一份脾样本检出埃立克体特异阳性带.序列测定结果显示,这
2、 3 只鼠所携带的埃立克体样微生物基因完全一致.该基因与核酸数据库中的埃立克体 Sehotti 株有最大同源性(99.04%o 结论此次发现的埃立克体与该基地流行的犬埃立克体 Gzh982 株和扁平埃立克体Gzh981 株有很大差异 .该菌在流行病学上的意义有待进一步研究.关键词:褐家鼠;埃立克体;基因中图分类号:R376 文献标识码:AEhrlichia-likeorganismwasfoundinRattusnorvegicusesinthesuburbandistrictofGuangzhouPANHua,LIUShi.zhong,MAYu?hal,TONGShi?de,SUNYang(
3、TheMilitaryMedicalInstituteinGuangzhouMilitaryArea,Guangzhou510507)ABSTRACT:AimToinvestigatethewildrodentinfectedbyEhrlichiainsuburbandistrict0fGuangzhouwherecanineehrliehiosiswasanoutbreaktwicebetween1998and1999.MethodsSamplesofbloodandspleenofwildrodentweredetectedbypolymerasechainreactionusingpri
4、mersspecificforthe16SrRNAgeneofEhrlichiagenus.TheDNAfragmentsamplifiedfromthesampleswereclonedandsequenced.TheobtainedDNAsequencesweresearchedthehomologoussequencesinGenBank.ResultsFourof26samplesfromwildmdentswerepositiveinPCRassay;allofthepositivesampleswerefromrats(Rattusnorgicuses).Thesequenceso
5、fthepositiveDNAfragmentinPCRassaywereidentifiedandmostsimilartothatofEhrliehia-likesp.Sch0thvariant(99.04%).CondusionTheEhrlichia-likeorganismintheratsisdifferenttoE.canisGzh982andE.platysGzh981thatcausedtheepidemiccanineehrllcNosisinthisregionin1998.Theeffectofthisehrlichia-likeagentintheepidemiolo
6、gyremainstobestudied.KEYWOlIDS:Rattus,zDr 岣 g 证 s;Ehrlichia;gene1998 年夏天,广州市郊某养犬基地暴发以发热,鼻出血为主要特征的犬埃立克体病,大批成年工作犬发病,损失很大,后经本研究室确诊,采取有效治疗方法,疾病得以控制.到 1999 年春夏之交,该病又一次在基地发生,并且波及到隔离圈养在 5kin之外的国#l-Jl 进种犬.为了解该病的发生和流行情况,作者开展了本地犬埃立克体病流行病学调查1-3】.在对基地抓捕的野生啮齿动物进行 PCR检测时,发现了与当地流行毒株不同的埃立克体样微生物,现报告如下.1 材料与方法1.1 标本的
7、收集于 2000 年 12 月和 2001 年 7 月两次在养犬基地周围菜地和山坡上布置捕鼠笼,共抓获褐家鼠 15 只,黄胸鼠 6 只,臭嗣蔚 5 只.心脏采血致死,收集抗凝血,血清和脾脏标本,一 80保存.1.2PCR 模板制备抗凝血(用 ACD 抗凝剂:0.48%柠檬酸,1.32% 柠檬酸钠,1.47%葡萄糖.6ml 血液用 lml 抗凝剂)分离白细胞后,用上海生工UNIQ 一 10 柱离心式基因组 DNA 小量抽提试剂盒提取 DNA,一 20保存备检.脾脏样本取 200mg 左右见方小块,置 1.5ml 离心管,用眼科小剪刀剪碎,加入 200t-tl 含消化酶的TE 缓冲液(10raMT
8、risHC1,pH8.0,lmMEDTA,500gg/ml 蛋白酶 K,0.5%Tween20),48消化 12h,其间多次振摇,至组织块消化完全.5000r/min 离心 5min,上清用酚:氯(1:1)仿抽提,两倍体*全军“九五“ 医学科研规划课题.95M035;作者单位:广州军区军事医学研究所.广州 51050742中国人兽共患病杂志ChineseJournalofZoonoses积的乙醇沉淀,50tITE 溶解,一 20*(2 保: 竽备检.1.3PCR 扩增用埃立克体属特异;I 物(见前所述4)对所提 DNA 样本进行 PCR 检测.PCR 反应系统为:10xPCRBuffer5tA
9、,2.5mMdNTP4,M,50M 引物各 1l,Taq 酶 1u,加水至 50tA.PCR 反应条件:95*(2 预变性 300s,94*(2 变性 60s,53*(2 复性60s.72延伸 90s.扩增循环 40 次,最后,72延伸10min.在含溴化乙锭(0.5m1) 的 1.5%琼脂糖凝胶电泳中进行 PCR 产物鉴定,长波紫外光下观察结果.一次 PCR 扩增为阴性的样本,再用第 1 次 PCR产物进行 2 次扩增(反应系统和条件与第 1 次相同).第 2 次还为阴性后才确认为阴性.1.416SrRNA 基因扩增及测序对埃立克体属特异性引物检测阳性样本,进行 16SrRNA 基因测定,所
10、用方法如前所述,即利用两对引物将几乎整个16SrRNA 基因扩增为 630bp 和 1020bp 的两个片段(两片段间有 173 个碱基重叠交叉).630bp 片段扩增采用引物 A17 和 P6,1020bp 片段采用引物为ECB 和 317.两片段的 PCR 反应系统和条件基本一致,只是 630bp 片段的复性温度为 48,1020bp 片段的则为 56.PCR 扩增产物经试剂盒(promega 公司产品)提纯,连接到 pGEMTeasyVector,转化到 JM109 宿主菌后,经蓝/白斑筛选法选出阳性克隆子,克隆子经鉴定后送北京赛百盛生物工程公司测序.1.5DNA 序列同源性检索所得序列
11、通过 Internet 进入美国国立医学图书馆/国家健康研究中心网站,进行同源性检索.2 结果3 只褐家鼠血液样本 PCR 检测阳性,其中 1 只的脾脏样本也检出阳性特异带.黄胸鼠和臭嗣睛样本均为阴性结果.阳性鼠样本测序后,得到一条 1494bp 的 DNA序列(图 1).3 只鼠血及脾脏样本的序列完全一致.这一序列与早先在该基地流行的犬埃立克体病病原有很大差异,与扁平埃立克体 Gzh981 株(登录号为AF162860)的 16SrRNA 基因相似程度为 91.97%,与犬埃立克体 Gzh982 株( 登录号为 AF156784)的相似程度是 92.17%.此外,与基因库中另一鼠埃立克体(E
12、.muris)的相应基因( 登录号为AB013O09)相似性也仅为 93.28%.将此未知 16SrRNA 基因通过 BIAST 对基因库(GenBank), 日本核酸数据库(DataBankofJapan)和欧洲分子生物学实验室核酸数据库(EuropeanMolecularBiologyLaboratorynucleotidedatbase)所登记的基因序列进行同源性检索,得知其与 Schouls 在荷兰篦子硬蜱中检到的埃立克体样Schotli 变异株(Ehrlichia likesp.Schotlivariant,登录号 AF104680)的相似性最高,达 99.04%.作者将此未知病原暂
13、命名为 EhrlichialikeRattusvariant,其 16SrRNA 基因已被基因库正式收录,登录号为 AY135531.L(X;LSEhrlichiallkc“lusvar1tLil491-DDNA09MAR 一 2002BSl00Ul4l5A288(424(367rIRlN.1(rlGAFCAT(GlCAGAACGAACGClAGCGGCAAGCrfFAACACAqGCAAGTCGAACGAA1G【AGTq,GTA1lTAClA_lAGCTGCAG(【GGCAGAC,(lGAGTAATGCAqAGGAA【2lTCr(C(【_AGlAGTAlGGAArAGCI,GlqAGAAlG
14、ACAGGTAAf【AC(ATAT从 TU;CI!GC61H1(;GGGAAAGM 兀 AICGCTAqTAGAlGGCCIATGTTAGAqTAGCrA州 lGGTAAGGrAAT241ACCT3ACCAAGGC1ArGATCVAIAGElGGTCTGAGAGGACGATCAGccACACq“从 CTG301AGA1ACGGfCCAGACICCIACGGGAGGCA(:CAGIlGGGGAATATTG(;C从 TGC( 从 G36lCCTGATCCAGCTAI(;CCGCAIGAGTGAAGAAGGCCTqG(GITG1AAA(;CTCTTTCAGCA121(,(;GAAGAI 从IGACG
15、GrACCTGCA(iAAGAAGICCCGGCAAACTCCGrGCCAGCAGCCGCG481G【AGAGGGGGCAAGC(;lGT1CGGAI,TATTGGGCGTAAA00GCATG.rAGGCGcT541lrAAlAAGTT从AG1GAAAIACCAGGGC1CAACTCTGGAGCIGCrFTTAATACTAFTTA6OlAACIAGAGATCGAGA(;A(;GArAGTG(AlrrrAG_【GrAGAGGrGAAA1“qCGTAGATA66tAGGAGGAACACCAG_lGGCGAAG(;CGACrA_【CTGGCICI rGACGcTGAGG【(;CCAAA721GCG】
16、 【0A0CAACGGAlI,AGATACCCI,GGIAGICCACGGT从cTATGAGTGCrA78lAAIGTGGGGAfAI,TTTATCICTGTATTGrA(;CTAACGCGTTAAGCAC【(GCCTGGGGAC84lIACC,GTCGCAAGACIAAAACTCMGG 从rTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTOGAGCAr901G【GGTTTAAT【cGArGCAACGCGAAAACC【TACCACIvrTTGAIATGAAGGI(:(ATcTg6ITlWTAACCGGAAGAGICAGmGCIGGACCFTACACAGGTGLqGCATGGcTGTCGTCA10
17、21(;CrCGTG1CGIGAGATGTIGGGTIAAGICCCGCAAC(;AGCGT 从CCcTTCTCCTlrAGTTG1081CCAACAGGTAATGCr(;GC,AACl,CTAAGGAAACTGCCAGTGTAACTGGGGAATGGl14lGArGATGICAGTCAGCAC(;GCCCrTATAAGGrGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAAC12【】1TACAAIAGGTIGCAAGATCGCMGT1,GAG 从 TCCA 从GlrIATCTCAGTTCGGATI261_【 GFTCTCTGrAACTCGAGAGCATGAAGCCGGAAICGCTAGTAA
18、TCGIGGAICAGCATCCCl321CGGTGTCGTTCCGGGI,CTTGTACACACTOCCCGTCATGCCCIGGA从 TTGGTTTAl381ACTCGAAGCGGTGAGCTAACCGTAAGGAGGCGcCTTTAAGGTTGGATCAGTGAc1,(;l44lGG 从 GTcGTAACAATAGGTAGGW 从CcTGCGGCTC,GATTCLTCC1【1图 1 埃立克体样微生物 16SrRNA 基因序列Fig.1The16SrRNAgenesequenceofEhrlichialikeorgan-ism3 讨论核酸分析技术和细菌鉴定观念上的进步,使得包括埃立克体在内
19、的真细菌分类鉴定更为直接和客观,在病原归属不明时,可将基因序列对核酸数据库扫描,从而确定其种属位置.在这方面,保守性极强的 16SrRNA 基因(62,成了细菌分类鉴定的“金钥匙“. 本次实验设计应用埃立克体属的 16SrRNA 基因特异引物,对所捕鼠进行 PCR 检测,就是基于这一原理.对 PCR 阳性样本,进行 16SrRNA 基因全序列测定.采用一对真细菌通用引物和埃立克体属特异引物,分别搭配后使用,可将埃立克体 16SrRNA 基因分两个片段扩增出来,测序时长片段由两端识读,而短片段则由一端识读,由于其间有碱基交叉重叠,对比拼接后即可将该基因的绝大多数序列读出.根据埃立克体 16SrR
20、NA 基因系统发育研究结果,可以将目前已经发现的埃立克体分为不同的基因群.研究报道指出(72,埃立克体属内各种间16SrRNA 基因序列相似程度为 84%99.9%,同一2003,19(5)中国人兽共患病杂志ChineseJournalofZoonoses43基因群内相似程度大于 97%,群间成员相似程度为84% 93%.本次实验发现的埃立克体样微生物,显然与该地区早先发现的两种埃立克体不一样,与Et 本发现的鼠埃立克体也有很大差异【8,应该是一株与荷兰篦子硬蜱中携带的埃立克体非常近似的病原【引,该病原与埃立克体属中的第一基因群相关性较大.其流行病学意义有待进一步研究.这是目前所知在褐家鼠中携
21、带的第一种埃立克体样微生物.虽然由于技术原因,捕获的野鼠数量不多,致使样本数不大,但因其感染率高(15 只褐家鼠中 3 只阳性),再加上褐家鼠是一种重要的医学动物,其主要栖息地是人畜的生活区,这种动物在预防医学和流行病学上有重要意义,因此,我们有必要对此给予关注.参考文献:1马玉海,胡永辉 ,林永清,等.广州地区犬染蜱季节消长规律J.中国媒介生物学及控制杂志,2001.12(6):481.2潘华.温博海 .蹇锐,等.广东部分县市犬埃立克体抗体调查.中国人兽共患病杂志,2002,18(2):122.3潘华,马玉海 ,温博海,等.广州地区犬血清埃立克体抗体季节消长规律【J.中国预防兽医,2002,
22、24(3):202.4潘华,马玉海 ,佟世德,等.我国某养犬基地发现犬埃立克体病.中国兽医,1999,19(1):26.5潘华,孙洋 ,佟世德,等.我国犬埃立克体病病原分离与鉴定I 病原 16SrRNA 基因序列测定与分析J.中国兽医,1999,19(5):467.6WoeseCR.BacterialEvolution(J.MicmbiolRev,1987,51:221.7BurtEA,JaequelineED,DanacJ,eta1.Ehrlichiachaffeensis,anewspeciesassociatedwithhumanEhrlichiosiaJ.JClinMicmblol,1
23、991,29(12):2838.8WenBH,RikihisaY,MortJ,eta1.Ehrllchlamuffssp.Nov.,IdentiffedontheBasisof16SrItNABaseSequencesandSerologica1.Morphological,andBiologicalCharacteristicsJ.IntJSy.Bacteriol,1995,45(2):250.9SchoulsLM,PolIV,RupkemaSG,eta1.DetectionandIdentificat.ionofEhrlichia,Borreliaburgd0rferiSemuLato,a
24、ndBartonellaSpeciesinDutchIxodesricinusTicksJ.JClinMierobiol,1999,37(7):2215.收稿日期:2003 一 O413;修回日期:2003 一 O6 一 O7文章编号:10022694(2003)05 004301隐匿型慢性血吸虫病 1 例李朝品朱玉霞中图分类号:R383.2 文献标识码:B患者,女,68 岁,安徽芜湖人,随女儿迁居安徽省淮南市已 12 年,因芜湖已无亲人,12 年以来没有再回芜湖.因腹胀,纳差,乏力 2 个月,于 1999 年 6 月 25 日就诊.患者 12年前曾因患血吸虫病住院治疗,无肝炎,疟疾病史.体检
25、:T37.5,Pl16,BP100/70.心肺( 一),腹平软,未扪及包块 ,无压痛及反跳痛.B 超检查:肝脏轮廓清晰,表面欠光滑,形态正常.实验室检查:Hb136g/L,WBC14.310/L,中性粒细胞 83%,淋巴细胞 14%,酸性粒细胞 3%,玎(一).左侧卧位直肠显微镜由肛门推进 12em,发现血吸虫卵聚集成簇.KatoKatz 法粪检虫卵(+), 三角烧瓶孵化法见针尖形,透明发亮,直线游动毛蚴.血吸虫抗原皮试及环卵试验均阳性.诊断:血吸虫病.用吡喹酮总剂量 120g/kg 等分 6d1:I 服治疗 1 周后,患者症状消失.半年后,血吸虫抗原皮试及环卵试验均为阴性.随访至今无任何异常.讨论:根据血吸虫病的临床表现及病理变化,可将其分为急性,慢性,晚期血吸虫病和异位血吸虫病.急性血吸虫病患者经治疗未愈,或未治自行退热的,可发展为无症状(隐匿型)和有症状慢性血吸虫病.本例患者曾因患血吸虫病住院治疗,12 年后因腹胀,纳差,乏力就医检查再次发现血吸虫病,推测与当年治疗愈后程度有关.患者现住地并非血吸虫流行区,因直肠镜检发现血吸虫卵后进行粪检,抗原皮试及环卵试验被确诊.提示在非流行区内应根据患者病史,相应的临床症状,体征和实验诊断,确诊或排除血吸虫病.收稿日期:20021109;修回日期:20030312作者单位:安徽理工大学医学院,淮南 232001
