1、冠心病新致病基因 MEF2A 第一、第八外显子突变的检测中国优生与遗传杂志 2006 年第 14 卷第 1 期?19?冠心病新致病基因 MEF2A 第一,第八外显子突变的检测李婧,陈汉想.杨钧国,杜容,桂乐,田莉,郭邱惠(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科,4300222.武汉工业学院科研处 3.武汉市第六人民医院,武汉 430000)摘要:目的研究冠心病新致病基因 MEF2A 在中国人群突变情况.方法利用聚合酶链反应一单链构象多态性(Dolymerasechainreactionsinslestrandconformationpolymorphism,PCRSSCP)和DNA 测序
2、技术对 156 例冠心病(CAD)患者第 1l-.x 子及第 8 外显子进行基因突变检测 .结果 MEF2A 基因第 1l-.x 子区域 6 例患者 SSCP 泳动异常,第 8 外显子区域 7 例患者 SSCP 泳动异常,但 DNA 直接测序未发现 MEF2A 基因第 1,8l-.x 子区域基因突变.结论冠心病患者在MEF2A 基因第 1,8l-.x 子未发现新的突变,PCRSSCP 结果与 DNA 测序结果并非平行关系,SSCP 同样存在假阳性.关键词:冠心病;MEF2A; 突变 ;单链构象多态性中图分类号:R394.5 文献标识码:A 文章编号:10069534(2006)O1001903
3、StudyonmutationofnewdiseasecausedgeneMEF2AinChinesepafienwithcoronaryarterydisease.LIring,YANGJunguo,LI 耽,DURong,GUILe,TIANLi,GUOQiu hui.(lt#uteofCardiology,MedicalCollege,HuazhongScieItceandTechnologyUniversity,Wuhan430022,cina)Abstract:Objective:ToexplorethemutationofMEF2Ageneexon1and8inChinesepat
4、ientswithcoronaryarterydisea8e(CAD).Methods:Mutationanalysisofexon1and8ofMEF2AgeneWaSperformedbyuseofpolymerasechainreactionsinglestrandconformationpolymoMsm(PCRSSCP)andDNAdirectsequencinginpatientswithCAD.Results:MobilityshiftofSSCPinexon1andexon8ofMEF2AgeneWaSdetectedin6caSesandin7caSesrespecfly.B
5、utnomutationWaSfoundinthepatientsbyDNAsequenceanalysis.Conclusion:Nomutationinexon1andexon8ofMEF2AgeneWaSfoundinthepatientswithCAD.Keywords:Coronaryarterydisease;MEF2A;Mutation;Polymerasechainreactionsinglestrandconformationpolymorphism冠心病是冠状动脉结构或功能异常,引起冠脉狭窄,痉挛或闭塞,造成心肌缺血或梗死的一组临床综合征.也称为缺血性心脏病.冠心病(CAD
6、)及心肌梗死(MI) 是欧美国家发病率和病死率最高的疾病.我国的发病率和病死率近年也呈明显上升,而且有年轻化趋势.1973 年 MikeBraun 和 JoeGoldstein 发现低密度脂蛋白(LDL)受体基因的突变而获得 1985 年的诺贝尔医学奖,此后发现对于一般的 CAD 和 MI 患者,脂代谢异常极大地增大了发病的风险,但它们不是引起 CAD 的决定因素,而可能是影响了某些关键致病基因的表达.2003 年 11 月 WangQ 等人发现第一个引起 CAD 和 MI的致病基因 MEF2A,其后 Bhagavatula 等人 2004 年发现MEF2A 基因第 7 外显子的 3 个突变点
7、,而中国人的MEF2A 基因的研究资料却很缺乏.我们在各家医院的协助下,对收集到的确诊冠心病患者第一,第八外显子进行 MEF2A 基因 SSCP 筛查后进行 DNA测序,以期发现冠心病患者是否可能存在 MEF2A 基因的新的突变位点,为进一步研究冠心病的致病机制打下基础.资料与方法一,资料1.研究对象和临床调查诊断标准(1)临床调查诊断标准患者来自中国湖北,黑龙江,河南,湖南等省,严格依据以下冠心病和心肌梗塞(MI)诊断标准进行病例的初选和临时调查,包括是否出现胸闷或胸痛,胸闷胸痛发作频率,次数,诱发因素,缓解因素,发作持续时间,心电图特征,是否具有冠心病家族史及烟酒史以及血脂状况,冠状动脉造
8、影结果.阳性病例最后确诊指标为:1)MI病人;2)冠脉造影显示冠脉狭窄 t70%,并有心肌缺血表现(STT 改变及/或心绞痛).可疑 CAD 标准:冠脉造影显示冠脉狭窄 350%,70%.(2)研究对象共选取 156 例患者.其中男性患者 119例,女性患者 37 例.年龄 3977 岁,平均年龄(50.410)岁,全部均符合 1979 年 WHO 关于缺血性心脏病的诊断标准 J,其中 80%符合上述临床调查诊断标准.2.试剂与仪器蛋白酶 K(Merck 公司和 Amemsco 公司),triton(Ameresco 公司),Tag 酶(Biostar 公司及 Takara 公司),dNTP(
9、晶美公司及杰辉公司),丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,甲酰胺等.台式高速低温离心机(eppendorfCentrifuge5417R),琼脂糖水平电泳仪(BIORAD),PCR 仪(AppliedBiosystemsGeneAmpPCR9700),MF311 多功能三维旋混仪(深圳潘西诺生物科技有限公司),DYY 一 2C 型电泳仪 (北京六一仪器厂),530 万像素数码相机(索尼 F88).二,方法1.血标本的收集和处理标本来源为冠心病患者的股动脉血或外周静脉血 46ml,经 EDTA 抗凝;一 20 或一80 保存.2.基因组 DNA 的获取 triton 一蛋白酶 K 法提取白细胞基因组 DN
10、A,置一 80 或一 20 备用.3.聚合酶链式反应(PCR) 扩增 MEF2A 基因外显子的引物序列由美国 cleveland 大学心血管疾病分子遗传中心的 WangQ 博士提供,由上海生工公司帮助合成.扩增 1 外?2O?中国优生与遗传杂志 2006 年第 14 卷第 1 期显子,8 外显子基因片段引物序列见表 1.PCR 扩增特异性循环参数为:第 1 外显子片段 25 体系:95C5min,94C30s,64C30s,72C30s,30 个循环后 72C7min 延伸.第 8 外显子片段 25 体系:955min,94C30s,62%30s,72C30s,30 个循环后 72C7min
11、延伸.表 1PCR 扩增 1,8 外显子片段引物序列4.单链构象多态性分析(singlestrandcomformationpolymorphism,SSCP)采用 11%中性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺=29:1),4PCR 产物加 4t.d变性上样缓冲液,98加热变性 5min 后取出立即置冰浴 810rain,上样于 11%凝胶,4 冰箱中 600V 电压垂直电泳 2.5h.5.银染及照相凝胶置于 10%乙酸固定 30mln,蒸溜水漂洗 3 次,每次 2mln,0.1%硝酸银染色 30min,蒸镏水漂洗20s,置于 1.5ml 甲醛与 2.8%碳酸钠混合液中显影至电泳条
12、带充分显现,10%乙酸中固定中止 10min,蒸馏水漂洗1min 后凝胶取出照相保存并分析.病例样本与正常对照相比,出现电泳带的加减或位置的移动,即说明该样品可能存在突变基因.6.DNA 直接测序将 PCRSSCP 筛查异常的标本用ABD730 测序仪做正反向 DNA 序列测定,由上海博亚生物技术有限公司和上海联合生物技术有限公司共同完成.结果一,PCRSSCP 结果 150 例患者中的 6 例患者的外显子 1PCR 扩增产物通过 SSCP 电泳出现异常条带,即泳动比正常多出条带或移动速度与对照有差异,表明这 6 例可能出现 MEF2A 基因突变,另有 7 例患者外显子 8PCR 产物 SSC
13、P出现异常电泳条带.(见图 1,图 2)l2345678910ll图 1MEF2A 基因外显子 1PER 扩增产物 SSCP 电泳结果图1 健康人 211CAD 患者 3458,10,11 泳动异常二,DNA 直接测序结果将部分患者标本(含 SSCP 筛查异常的样品)PCR 产物进行正反双向测序 ,结果用 Chromas软件进行 BLAST 分析后,再将测序峰与 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/网上检索结果重新比对,结果未发现有缺失,插人,置换等基因突变的改变.测序结果见图 3,4.讨论冠心病是最常见的心脏病之一,被认为是多种遗传因素,l23456789l0lI12l31
14、4l51617图 2MEF2A 基因外显子 8PCR 扩增产物 SSCP 电泳图9DNA 标准物 5 健康人,其余为 CAD 患者2,3,8,10,12,15,17 泳动异常环境因素以及其它各种因素的相互作用产生的疾病,严重危害人类健康,而且发病有年轻化的趋势.MEF2A 基因是我国留美学者 WangQ 博士领导的研究小组于 2003 年在一个冠心病家系(13 个病人其中 9 人发展为 MI)中通过连锁分析发现的第一个引起 CAD 和 MI 的致病基因,他们在 MEF2A 基因的第 11 外显子发现了一个 21个碱基的缺失从而导致 7 个氨基酸(440QPPQPQP446)缺如,并指出 MEF
15、 蛋白在冠脉内皮细胞中高表达 .Bhagavatula 等人 2004 年在 207 个散发病例中发现了 3 个新突变位于第 7外显子(G263S,P279L,G283D),并指出突变率在 CAD 病人中接近 2%.MEF2A 位于染色体 15q26.3,在冠脉内皮细胞中高度表达,提示 CAD 和 MI 的发病机理可能是基因突变使基因表达的转录过程发生改变,从而使内皮发育异常,导致冠脉粥样硬化的发生.我们采用 SSCP 法筛检出可疑突变片段,然后再将片段进行测序,可以在经费有限的条件下,以最少的物力到最终实验目的,适用于大样本筛选,可有效检测 PCR 产物中引物之问片段的基因变异,灵敏度高,不
16、受 PCR 扩增差异的影响,是一项有效测定 DNA 序列变化的筛查技术.为避免 Ss-cP 出现假阴性,我们采用小片段(156bp 和 222bp)检测,并对每份 PCR 产物均作了加甘油及不加甘油的凝胶进行了电泳的双重检测步骤,以免漏掉可能的突变.为使电泳条带更清晰,且底色不致过深,我们在银染后显影前谨慎严格地用蒸镏水漂洗 20s,从而达到最好的染色效果.我们筛查了 MEF2A 基因的外显子 1,8 后 SSCP 结果部分可疑阳性,但 DNA 测序结果均为阴性,说明 PCRSSCP结果与 DNA 测序结果并非平行关系,SSCP 也同样存在假阳性,这与众多研究者认为 SSCP 存在假阴性而易漏
17、检而非假阳性的观点不同,考虑原因可能是:1.PCR 非特异扩增影响了条带;2.即便是正常人样本,其 PCR 产物的单链带也可能会因个体的不同而存在不同的构像,从而导致正常对照出现多种类型;3.不明原因.与国外人群未发现 1,8 外显子突中国优生与遗传杂志 2006 年第 14 卷第 1 期?21?.量 l.:5 一.3,I:童:篓蔷每鼻01,7,.-I1902:0:2e:0嚣蕊啊:z 叠船譬:西露!10:;嚣器蠢墨娶嚣35图 3MEF2A 基因外显子 1 正反向测序结果t035图 4MEF2A 基因外显子 8 正反向测序结果变相同,目前中国人未在第 1,8 外显子发现突变,但这并不能说明不同种
18、族就存在相同突变热点,尚需扩大样本,进一步求证.我们所收集的病例尚有限,所作的工作远未完成,需进一步筛查其它外显子并利用 DNA 测序技术确定突变位点,以便进一步进行功能研究,从而对中国人群冠心病的基因诊断和治疗提供帮助.参考文献1WangL,FanC,TopolSE.eta1.MutationofMEF2AinaninheriteddisorderwithfeaturesofcoronaryarterydiseaseJ.Science,2003,302:15781581.2BhagavatulaMR.FanC.ShenGQ.eta1.TranscriptionfactorMEF2AmutationsinpatientswithcoronaryarterydiseaseJ.HumMolGenet.2004.13:31813188.3国际心脏病学会和协会及 WHO 临床命名标准联合专题组报告.缺血性心脏病的命名及诊断标准J.中华心血管病杂志.1981.9:75.4张维铭.主编 .现代分子生物学实验手册M.北京:科学出版社.20038788.收稿日期:20050630
