1、第六章第二部分 液相免疫沉淀试验大家好！本节课我要跟大家一起学习的内容是液相免疫沉淀试验。在上次课中，我们提到免疫沉淀试验可分为液相免疫沉淀试验和凝胶内免疫沉淀试验。本次课我们将重点介绍一下液相免疫沉淀试验的定义和分类。那么，什么是液相免疫沉淀试验?液相免疫沉淀试验是指可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的液相介质中反应，从而形成肉眼可见的沉淀物。（在介绍此标红部分内容时插入下面的幻灯）根据实验方法和所形成的免疫复合物呈现的沉淀现象的不同，可以将液相沉淀试验分为环状免疫沉淀试验、絮状免疫沉淀试验和免疫比浊测定。其中环状免疫沉淀试验和絮状免疫沉淀试验是经典的免疫沉淀试验，但环状免疫沉淀实验因为标本需
2、求量大、灵敏度低，分辨率差，且只能定性，目前临床上已经几乎不用了。而免疫浊度测定又分为透射免疫比浊试验和散射免疫比浊试验，是临床实验室目前应用最广的免疫沉淀试验。接下来，我们来学习一下絮状免疫沉淀试验。絮状免疫沉淀试验是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见的絮状沉淀物。这个方法受抗原抗体比例的影响非常明显，因而常用于测定抗原抗体反应的最适比例。絮状免疫沉淀实验常用的操作方法有三种：抗原稀释法、抗体稀释法和方阵滴定法。首先，让我们来了解一下抗原稀释法。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）抗原稀释法是指将抗原进行一系列倍比稀释，与一定浓度的相应抗体等量混合，在适
3、当条件下反应后，形成的沉淀物的量随抗原浓度的变化而不同，以出现沉淀物最多的管作为抗原最适比例管。絮状免疫沉淀试验的第二种操作方法是抗体稀释法。抗体稀释法与抗原稀释法操作方法相同，唯一不同的就是由原来的对抗原进行稀释变成了对抗体进行稀释。絮状免疫沉淀试验的第三种操作方法是方阵滴定法，又称棋盘滴定法，是抗原稀释法和抗体稀释法两种方法的结合，它的一般操作是将抗原抗体同时进行倍比稀释，根据出现最大沉淀量时的抗原抗体稀释度，确定出抗原抗体反应的最适比。这个方法可以一次性完成抗原抗体的滴定，并找出抗原抗体反应的最适比例。 刚才介绍了絮状免疫沉淀试验，下面我们一起来学习一下第二种液相免疫沉淀试验-免疫浊度测
4、定。免疫浊度测定（Turbidimetric inhibition immuno assay）是利用抗原抗体结合后，在液体中形成的免疫复合物会对透射光或散射光强度产生影响，通过现代光学测量仪器检测透射光或散射光强度的变化，然后再用分析系统对采集到的数据进行分析、计算，最终实现对各种液相介质中的微量抗原或抗体进行定量测定的目的。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）它的基本原理是：可溶性抗原与相应抗体在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成较大的免疫复合物，使反应液出现浊度，当反应液中保持抗体过量且浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着待测标本中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反
5、应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出样品中抗原的含量。 免疫浊度测定的最大优点是稳定性好，敏感度高，准确度高、简便快速，易于自动化。根据仪器测量方式的不同，免疫浊度测定可以分为透射免疫比浊试验和散射免疫比浊试验两种，1977年，Sternberg建立的速率散射比浊法是目前定量测定微量抗原物质广泛使用的一种免疫比浊测定方法，它具有高灵敏度、快速、可自动化等特点。在应用免疫比浊测定方法时，应注意以下几点：1、抗原或抗体量如果大大过剩，可出现可溶性复合物，造成误差。2、应维持反应管中抗体蛋白始终过剩。3、易受到脂血的影响。首先，我们来学习一下透射免疫比浊试验。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图
6、片）透射免疫比浊试验是指可溶性抗原与相应抗体，在一定缓冲液中结合形成免疫复合物，使反应液浊度发生改变，当一定波长的光线通过反应液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而引起透射光减少，可用吸光度表示，吸光度与免疫复合物的含量成正比。在保持抗体过量的条件下，吸光度与抗原含量成正比。用已知浓度的标准品建立标准曲线，即可计算出待测标本中的抗原含量。（在介绍此标红部分内容时插入下面的文字）透射免疫比浊试验的优点是操作简便、快速、结果准确性较好、能用全自动或半自动生化分析仪进行测试，敏感度比单向免疫扩散试验高5-10倍，但这个方法抗体用量大，并且为保证反应体系当中抗体始终保持过量，反应前必须预先测定抗体含量值
7、；耗时长，抗原抗体结合后需要几分钟甚至几个小时才可以形成肉眼可见的免疫复合物，速度太慢，目前多用增浊剂加速免疫复合物的形成；抗原或抗体极度过剩时，易导致免疫复合物分离，严重影响结果测定的准确性，另外，这个方法不适合半抗原比如小分子药物的检测。接下来，我们再一起学习一下散射免疫比浊实验。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）散射免疫比浊试验的原理是抗原抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的免疫复合物，当一定波长的光通过该反应液遇到免疫复合物时光线发生散射，散射光的强度与免疫复合物的含量和散射夹角成正比，与入射光波长成反比。当散射夹角和入射光波长一定时，散射光的强度与免疫复合物的含量成正比，当反
8、应体系中保持抗体过量时，形成的免疫复合物含量又与抗原含量成正比。应用标准品制作标准曲线，通过检测散射光强度，即可计算出待测标本中的抗原含量。根据散射光检测时间及检测方式的不同，散射免疫比浊试验又可分为终点散射比浊试验和速率散射比浊试验两种。那么，什么是终点散射比浊试验？（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）终点散射比浊试验是在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。在抗原抗体反应的第一个阶段，溶液中产生的散射光信号波动比较大，所获得的信号计算出的结果会产生较大的误差。终点散射免疫比浊试验避开了抗原抗体反应的不稳定阶段，在抗原抗体反应的最佳时段读数，将误差降到最低，并且必须在免疫复合物相互聚合形
9、成絮状沉淀之前完成测定，否则光散射值会降低，得出的结果也偏低。因此，终点散射比浊试验是在免疫反应进行到合适的时间时才进行比浊度的测定。因此，又称为定时散射比浊试验。终点散射比浊试验有众多优点：比如，检测灵敏度较高，可以达到ug/L水平,高于透射免疫比浊试验，但低于速率散射免疫比浊试验；可自动化分析；在抗原抗体反应的第一个阶段，反应时间比较长，不适合做快速检测；另外，在微量测定时，本底的干扰会影响测定的准确度，计算的时候要注意减去本底值。速率散射比浊试验有别于终点散射比浊试验，测定的不是某点的比浊度，而是测定的一段时间内不同时间点的比浊度。所谓速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速度或免疫复合物形
10、成的量，而不是免疫复合物累积产生的量。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）从下面这张图中我们可以看出，抗原或抗体混合后瞬间发生反应，抗体过量的情况下，抗原抗体反应速度由慢到快，在单位时间内所产生的免疫复合物是不断增加的，随后逐渐减慢，在此变化过程当中，在某一时间点抗原抗体反应速率最快，单位时间内产生的免疫复合物的含量达到最大值，此时散射光的强度变化也是最大的，这个时候，我们称它为速率峰。（在介绍此标红部分内容时插入下面的表格）从下面的这张表中，我们可以看出，在25s左右时，抗原形成的速率为90ug/s，由此可以看出，速率峰出现在25s左右，并且速率峰的峰值与抗原浓度成正比。选取速率最大，并
11、且与被测抗原浓度变化呈线性关系的速率值，制作剂量反应曲线，即可计算出被测抗原的浓度。速率散射比浊试验比较于投射免疫比浊试验和终点散射比浊试验，具有速度快，灵敏度高，精密度高，特异性强，稳定性好，检测范围宽，自动化程度高，节省试剂等优点，但是该方法也有缺点，比如所用的仪器试剂都比较贵，对抗体的质量要求比较高。最后，我们来介绍一下第三种免疫浊度测定的方法-胶乳增强免疫浊度测定。不管是透射免疫比浊试验还是散射免疫比浊试验，免疫复合物产生量过少时均难以形成浊度，这是导致免疫浊度测定特别是透射免疫比浊试验敏感度不高的主要因素。采用胶乳增强免疫比浊测定，克服了上述缺点。它是将抗体吸附在大小合适、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，使胶乳颗粒发生凝集。（在介绍此标红部分内容时插入下面的图片）单个胶乳颗粒在入射光波长范围内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时透射光就会减少，并且减少的程度与胶乳颗粒凝集程度成正比，同时与预测抗原含量成正比，通过检测光强度的变化，就可以计算出待测标本当中的抗原含量。本次课我们主要学习了液相免疫沉淀试验的定义及分类，重点要理解其分类。最后，给大家留一道思考题：本节中哪个试验更适合微量抗原的检测？本节课就学习到这儿。谢谢大家！
