1、蛋白质印迹(Western Blot)Co n t en t s目 录0102031.样品准备2.电泳 3.转膜4.封闭5.一抗孵育+-7.显影YY90YY目的蛋白：一抗：Y 二抗：Y HRP：发光检测：YY YYYY6.二抗孵育实验流程样品类型 抽提液(Lysis buffer)全细胞 NP-40或RIPA细胞质可溶蛋白 Tris-HCl细胞骨架蛋白 Tris-Triton细胞膜蛋白 NP-40 or RIPA细胞核蛋白 RIPA 或核抽提液线粒体蛋白 RIPA 或线粒体提液1.样品准备（Sample preparation）u裂解缓冲液u蛋白酶或磷酸酶抑制剂u蛋白定量试剂u上样前样品准备：
2、蛋白变性/非变性，还原/非还原样品收集蛋白收集细胞核细胞质细胞骨架蛋白细胞膜蛋白线粒体实验流程抑 制 剂 蛋 白 酶 裂 解 液 中 的 浓 度抑酶肽胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纤维蛋白溶酶2 g/mL亮肽酶素 溶酶体酶 510 g/mL抑肽素A 天冬氨酸蛋白酶 1 g/mL苯甲基磺酰氟化物（PMSF）丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶 1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）需要Mg2+和Mn2+的金属蛋白酶 5 mM乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）需要Ca2+的金属蛋白酶 1 mM蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors）选择实验流程蛋白定量（Determination of protei
3、n concentration）考马斯亮蓝法（Bradford assay）Folin-酚试剂法（Lowry assay）二喹啉甲酸法（Bicinchoninic acid(BCA)assay）紫外吸收法（A280）实验流程S操作简便迅速，消耗样品量少，经济。优点高浓度的Tris、EDTA、甘油和去污剂对测定有一定干扰。缺点W考马斯亮蓝法（Bradford assay）考马斯亮蓝G-250与蛋白结合后形成蓝色化合物，在595 nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。蛋白定量（Determination of protein concentration）实验流程S与Bradfo
4、rd法相比，BCA法操作简单，复合物稳定，灵敏度高，不受去垢剂影响。优点但具有较昂贵的费用。缺点W喹啉甲酸法（Bicinchoninic acid assay）(BCA)碱性条件下，蛋白质分子中的肽键能与Cu2+生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+，并与二喹啉甲酸钠盐结合形成稳定的紫蓝色复合物。该化合物在562 nm处有高的吸光值，并且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。蛋白定量（Determination of protein concentration）实验流程l 上样量：50-100 gl 上样缓冲液l 95，5-10 min上样前样品准备（Preparation of
5、 samples for loading into gels）实验流程2.电泳（Electrophoresis）蛋白分离原理电场作用下，蛋白在聚丙烯凝胶中迁移速度与其分子大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基硫酸钠（SDS）能与蛋白结合，改变蛋白原有构象电荷数，使不同蛋白之间具有相同的构象和电荷，只存在分子量之间的差异。因此，在SDS-PAGE中蛋白质依分子量大小分开。SDS-PAGE的配制不同浓度的凝胶对应不同分子量的蛋白蛋 白 分 子 量(kDa)凝 胶 浓 度(%)4-40 2012-45 1510-70 12.515-100 1025-200 84-40 20溶 液 成 分分 离 胶(1
6、0%)浓 缩 胶(4%)ddH2O 4.1 ml 1.525 ml4x 分离胶缓冲液(1.5M Tris-HCl pH8.7)2.5 ml4x 浓缩胶缓冲液(0.5M Tris-HCl pH6.8)0.625 ml30%Acr:Bis 3.3 ml 0.325 ml10%SDS 100 l 25 l10%APS 50 l 15 lTEMED 10 l 5 l引发剂，提供氧自由基形成凝胶保持蛋白变性催化剂SDS-PAGE胶的配制实验流程1配制PAGE胶时，注意胶内不要有气泡2电源正负极不能接反3电泳缓冲液要新鲜配制电泳注意事项实验流程3.转膜(Transfer)转膜：将电泳后分离的蛋白质从凝胶中
7、转移到固相载体（例如NC膜或PVDF膜）上的过程。u常用转移方法有湿转和半干转。u湿转操作容易，转移效率高。u半干转适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。实验流程将胶浸于转移缓冲液中平衡5 min依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡5 min，如用PVDF膜需用甲醇浸泡3-5秒。装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，赶去气泡。将转移槽置于冰浴中，放入三明治（膜的那一面对正极），加转移缓冲液，插上电极，100V，1.5h（电流约为0.3A）。默克密理博（Millipore），蛋白质印迹技术手册（第六版），2015转膜步骤（以槽式湿转为例）实验流程1 海绵
8、-滤纸-膜-胶-滤纸-海绵之间不能有气泡2 正负极不能接反3摸索最佳转膜时间转膜注意事项4冰浴中进行实验流程u封闭只是对PVDF膜上未结合蛋白的部位进行封闭，对已结合蛋白的部位不会有任何影响，正常的封闭可以降低非特异性结合。u常用的封闭液为5%的脱脂奶粉或BSA。4.封闭(Blocking)实验流程一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等，尽量选择验证过适用类型的抗体。1、分析抗体适用的实验方法一般抗体说明书都列出该抗体经验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、goat等样本的实验
9、，应选择物种相同或有交叉反应的抗体。2、分析蛋白来源的种属5.一抗孵育（Primary antibody incubation）一抗的选择实验流程抗体由不同免疫原免疫宿主制备得来，免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽等，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。3、分析蛋白的结构性质偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于WB而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗。4、
10、分析一抗的宿主物种一抗的选择实验流程1 一抗的浓度2抗体孵育的条件注意事项实验流程二抗必须是抗一抗来源物种的抗体一抗的物种来源对于单克隆抗体，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。如果一抗是小鼠IgM，二抗就应当是抗小鼠IgM；如果一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。一抗是属于哪个类或亚类二抗的选择6.二抗孵育（Second antibody incubation）耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP等），荧光基团（FITC,R
11、RX,TR,PE等）和生物素。选用哪种探针标记的二抗主要取决于具体的实验。对于Western blot最常用的二抗是酶标二抗和荧光基团标记的二抗。选用哪种探针标记的二抗实验流程12 二抗稀释的浓度注意事项一抗的宿主3二抗稀释液不能含叠氮钠(HRP)实验流程Western Blot显色的方法主要有以下几种：放射自显影。底物DAB显色。底物化学发光ECL。底物荧光ECF。7.蛋白检测（Protein detection）实验流程利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，实现放射性标记物的定位和定量的检测。灵敏度高、分辨率好、保存时间长久。实验所用放射性物质对人体有辐射作用。放射自显影利
12、用3，3-二氨基联苯胺（DAB）可和辣根过氧化物酶（HRP）作用形成褐色不溶性产物，对目标蛋白的显色。操作简单。灵敏度低，现配现用，有较强的毒性。底物DAB显色实验流程实验流程ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，大部分Western blot显色底物是化学发光。灵敏度高，需要曝光检测设备或凝胶成像设备。利用标记不同荧光染料（如Cy2,Cy3,Cy5）的二抗，分别对应相应的目的蛋白，通过检测荧光染料的信号强度，实现蛋白信号的检测，以进行精确的定量分析。允许在同一张转印膜上用不同颜色的荧光底物同时检测不同的目标，间接实现一次实验可检测多种蛋白参考资料：1.默克密理博（Millipore），蛋白质印迹技术手册（第六版），20152.艾博抗（Abcam），蛋白质印迹指南3.赛默飞世尔（Thermofisher），免疫蛋白印迹实验方案下一讲：蛋白质印迹常见问题分析
