1、大鼠视网膜脱离及复位状态下存活的视网膜神经节细胞计数中华眼底病杂志 2004 年 7 月第 2O 卷第 4 期ChinJOculFundusDis,July2004,Vol20,No.4大鼠视网膜脱离及复位状态下存活的视网膜神经节细胞计数卢华马志中曹利群刘敬233?实验研究?【摘要】目的探讨神经节细胞(RGC)在实验性视网膜脱离及复位状态下的反应 ,检测白介素一 1B(IL 一 113),白介素 1 受体拮抗物(ILIRa)在 RGC 丢失过程中的作用.方法 73 只SD 大鼠用 1 荧光金(FG)经上丘,外侧膝状体逆行标记,healonGV(1.4 透明质酸钠)鼻侧视网膜下注射.10ngII
2、IRa 和500ngIL 一 1B 抗体随 healonGV 一同注入视网膜下.对逆行标记后 10d,视网膜脱离后 2h,1,3,5,7,10,2O,5O,90d,视网膜脱离 10d 复位 30d,视网膜脱离 90d 复位 20d,II1Ra 和 IL 一 1B抗体视网膜下注入后 1d 和 10d 取材的视网膜进行铺片,在荧光显微镜下拍片,进行 RGC 计数.对照组则在球内注入相应计量healonGV.结果视网膜脱离后 2h 开始有 RGC 的丢失,1d 时达到高峰,然后缓慢下降.在未脱离区,亦有 RGC 的丢失 .视网膜脱离 10d 后复位(早期复位 )可停止 RGC 的丢失,视网膜脱离 9
3、0d 后复位(晚期复位)可使 RGC 进一步丢失,最后停留在某一水平.IL 一 1B 抗体,II1Ra 可以减少这种丢失.结论视网膜脱离状态下,脱离区与未脱离区都有 RGC 的丢失.早期复位可使 RGC 的丢失停止,晚期复位可进一步损伤 RGC.拮抗 IL 一 1B 能减少 RGC 的丢失,IL 一 1Ra 对 RGC 有保护作用.【关键词】视网膜脱离/治疗;细胞计数;白细胞介素 1;受体,白细胞介素 1;疾病模型,动物中图分类号:R774.12R44639Thenumericalcountofsurvivorretinalganglioncellsindetachedandreattache
4、dretinainadultratsLUHua,MAZhizhong,CAOLiqun,eta1.Departmento/Ophthalmology,7heGeneralHospital(PLA,Beiing100853,ChinaCorrespondingauthor:MAZhizhong,Email:mazz(AbstractObjectiveToinvestigatetheresponseofretinalganglioncells(RGC)indetachedandreattachedretinainadultrats,andtheeffectofIL 一1betaantibodyan
5、dIL1RaonthelOSSofRGC.MethodsAtotalof73SpragueDawley(SD)ratsweresubretinallyinjectedwithhealonGV(1.4hyaluronate)andretrogradelabeledwithfluorogold(FG),and1OngILIRaand500ngILlbetaantibodywereinjectedintothesubretinalspacecombinedwithhealonGV.Theretinalflakeswereobservedunderthefluoroscopeandthenumbero
6、fRGCwascounted2hours,1,3,5,7.1O,2O,50.and90daysafterdetachment;10daysafterdetachmentand30daysafterreattachement;90daysafterdetachmentand20daysafterreattachement,and1and10daysafterinjectionwithILlbetaantibodyandIL 一1Ra,respectively.AndthecontrolgrouPwasonlydevelopedanintraocularinjectionofthesamevalu
7、meofhealonGV.ResultTwohoursafterdetachment.theRGClOSSwasfound.reachedthepeakatfirstday,anddecreasedgradually.RGClOSSwasalsofoundinthenondetachedarea.Thereattachment1Odaysafterdetachment(earlyreattachment)stoppedthelOSSofRGC,andthereattachment90davsafterdetachment(1atereattachment)promotedthelOSS,whi
8、chrestedonacertainleve1.SubretinalspaceinjectionofII1RaandII 一1betaantibodydecreasedthelOSSofRGCsinthedetachedretina.ConclusionTheRGCslosswerefoundbothinthedetachedandattachedretina.EarlyreattachmentmaYstoDthelOSSofRGC,andlatereattachmentmaypromotethelOSS.BothII 一 1betaantibodyandII一 IRahaveneuroDro
9、tectiveeffectonRGC.KeywordsRetinaldetachment/therapy;Cellcount;Interleukin 一1;Receptors,interleukin 一 1;Diseasemodels,animal视网膜脱离经常导致严重视力下降甚至视力丧失.有研究表明,视网膜早期复位的几天或数周后,遭破坏的光感受器细胞外节可以得到良好的恢复 n,但作者单位:100853 北京,解放军总医院眼科(卢华,曹利群 ,刘敬); 北京大学第三医院眼科中心(马志中)通信作者:马志中,Email:是早期成功复位了的视网膜仍不能恢复正常的视力.Faude 等在兔视网膜脱离模型
10、中发现,在视网膜脱离的早期就有内,外层神经元的变性.我们通过检测大鼠视网膜脱离区,未脱离区及复位区的视网膜神经节细胞(RGC)数目的改变,以探寻神经元细胞变性的奄化规律艟视网幞复伸对其的作川I 材料和方法-I府志午 fHt4(-tinJ1lndusJjYzIVol:No1l 实荨龟动物健康 Sprag 一 i)awlytsn)大融 73 疑.雌各半.鼠龄 6 一一 28 蒯,体重 I;0200g 验分为 17组其叶 1 视同甍脱离 2h5,7【)d 组及对照组.何组 4 只大鼠;税州膜脱离 t0d 纽 10H 大鼠:视网膜脱离 9OdgR 鼠白彳 r 紊一 l 叠体拈拉物 fI1.Ra)干捌
11、1rl,IlIR 下丽 1nd.白升索】 【ILl【) 抗体 1预 1d 和 IL 一 1 抗忭 r 雄 10d 婀.每绸 5 只儿鼠;视网膜脱离 1d 蛆 6 只凡鼠双 m 均做舰瑚艇脱离模型井对 4 兄视网腑离 9d 大丽琏行双眼视网唑复付nd.山批 l 卅膜脱离 0d 复位 20d 组:刊 5 足视阿膜脱离 10d 太鼠双眦视 M 腔复佗 30d.为视网膜脱离d 复位 30d 组1.2 模珲!耕作I.2.1 视网膜脱离幔型制备 In 小台氯酲按 35m1/kg 舯剂鼙腹腔丰酣麻酐太鼠复方托品雠崆敞随在手术显微镜下(30()-H 率 loIcon 公,剪外侧球结陛,幂露赤遵郁巩膜.船丌涡状
12、静脉作板层巩幢微小扳层 1=fJ 口角膜缘处做前房水破出降低限雎从巩膜板丌缓慢斜行进人如 G 针头美国 Sigma 公司),雏瞳孔区说下或前置镜下 l 吖见遗 l!日鞍软崎视网脱与较硬半透叫的巩膜.随着 3uG 针头的缓慢探进.即可清晰看到两层膜川 m 小的舒离.邀刚将什轻轻堪.片浊劓古 l4c 遥明揩随钠的 healonv,血全鼻刚视网膜脱离太约占整个桃 H 葜的 1/2t1),局i 滴川庆霉累限药水.铺甲球结嗾对照组世行菏穿刺,巩膜榧层及穿刺,球内_丰射柑应量的 hea1(V翻;Tnl1rit【】dLahml1l2.2lIlRa,IL1 口抗侔的效应在制作桃 1 叫膜脱离模型的同时.随 l
13、lt,nGV 在每 R 眼注I【1Ibt 美崮.Samacruz 公)10lg.分别于 1.10d 后处死动物随 lIll1GV 分别住每只限址人 lIlI(美国Endogen 公司)抗体 500ng,分别扎 1,10d 斤处砭动物.1.2.3 视网膛复忙 l 樘型的制备刘视网艟脱离 10tI组 5 皿 k 鼠盟税阍腆脱离 gud 组 4 最大鼠进行散艟,麻醉.方法嗣前暴露鼻棚 0 办遭部 J 旯脞,做巩膜到口 ,放出视阳腹下 hatonGV 手术后铺平球结雕 .废霉束眼曲水点.并分别于酬废复位后 3020d 叫捅除眼球.1.3RGC 逆行标记处兜动物前】o.参考 ViIlegaPerez 等
14、的法定位,用 5 微量进样器墩蒲于 0.1tool 儿的磷酸盐缓冲辅(plI7.4)中的 J 荧光金 fI()含 1 一甲基砜(DMSO).用啦式血管钳尖仕僦量世羊器的尖端,使端露出的 k 度等十各点琏 tl 椿世,歙次经 4骨 fL 将 FG 洼麒恻 f(椿度 46t 叫?) 和外侧胯状津(深度 56mn1).每点拄射 2 在 1min 内注射完毕.井辑悄针 1winI.4 取材视网腰脱离 2j11.3,5,1O.2O.50.90d 鲥幔网睦 0 离 0d 复值 30d 组税网膜脱离 d 复位d 组,LI10ng 十坝 1d 组,lIrLRatuE1 硬J0d 纰,rll8 抗体 500E
15、十撷 1d 鲋.IIJ-l0 捕傩500“g 干 l 而 10d 蜘对照组 k 鼠在蜘 内注射 hPalrm(;V 后 2.麻醉 F 虬材(所有动物在取材 1od 前升颅行逆行杯)分别将动物缒注 I 定每考茜蔚等的方法性个栅同艘铺 H.i5RGCit-数在扼光散镜观察视 l 嗍啦铺.用紫外垃(UV)滤兜片 (15/420Jim)激发 FGl 搬 20(I 倍 F 艄H?同叫扣摄计数的格片 l 计算蚀古 i太倍率 l,挑野的 I 秘 1,6n()Jtm).扯每张视网膜的鼻恻脱离区中删部拍摄 3 推 j!c!片.在对彻束脱离医舳 -周部拍摄 3张片.双盲法计数.取半均教在 i数时 H 计荧光边葬清
16、晰的母十细胞(2)崩解的细胞(翻 3)不在计数范围内16 统 学丹析采用 StaI;.7.0 系统分析软件划备组各时间点14.G1l+数求均数厦标差对视膜脱离与冲绎节细胞存活的戈系进行线性阿 i 分析组问比较用 f 检验 ,2 结果21 桃脱脱离毁 R0(丢戈砬用 FG 标视网膜 RGC 数目结果显示.无论在盛验组或对嗽.所桥记的细胞均丽为萁清晰的示出带有轴突砬树宾的节细胞绌胞体.诎|凡为是 K【:t在对照组.鼻侧 R(【的 r 均桁崖为 (1929 上 205)个/ram. 把其定为 1 的鼻侧视网膜存浦 R(r 数目?用柬与史验组进行比较;颍侧视嘲膜 RGC 的平均密度为(2189 201
17、)十/mm.把茸定为 l_【)的颓伽概网膜存浦 R(;(散.用来与其验组进衍比较逆行标记 RGc 结娃示.RGC 扶网膜脱离 2h 斤就有丢失.并住 2lh 内边到 1 旬峰.然后呈缓慢 F 陴趋势在栅刚塍悦离 2h,1,3,5,7,10,20,50,90d 绢脱离的RGC 仔别(1235+7),(791 土 178),f8n 士【7).(774 十 15I),(73l 土 llJ】(8 州131).(7221I53),75J 土 z03).(683/G81 个/mmR(:(存活与脱离时间的长短壁画数关系(Y 一 758121)5117087OO02) 【图 10)22 丰脱离 RGC 的缓懂
18、丢失时颚侧未脱离区的视网膜进行各十时间点的RGC 计数发现 .随着对侧视网脯脱离区的存在 .未脱离区的 RGC 水柯不同稃度的死亡 .升随蕾脱离曲存来脱离 R【f 数呈缓慢趋势【强 49)正常刊照纽,帆嗍膜脱离【O.21)9od 组束脱离区的R(存恬数分别是(2189 上 201)(17913(H)(1611 上 30,t),(1468 士 161)十/ram 未脱离 R(;(的存惜脱离时问的长短函数差系(Y 一】486344 十 7z3.378909237)(幽 l0)23 视网膜的复位后 RGC 的 l 失情况对脱离 10d 的视网膜讲每伸.趟_I)d 后观网膜情片的察帮现.复伸组(R11
19、 士 71】个一 8与脱离 10 组脱离医 r(804l31)个/ram,IORGC 存活数差砰尤显着的意义 f,一一 3.6707.P 一0006).脱离 fl 的视网膜复位后 20d 的观嗣 H 铺片-h.复位区岫 RGC 存活数(4H 十 l_1,r/mm:川=8脱离(3 士 8)十 m.一 9fllj 减少一?787q.P 二 00),f 瑷凯糍一麓爨一黧崴翥一辩瑟器236ggU0中华眼底病杂志 2004 年 7 月第 2O 卷第 4 期ChinJOculFundusDis,July2004.Vol20,No.4时间(d)图 l0 人鼠 l 叫膜脱离区 0 术脱离区 RGC 细胞计数曲
20、线图Fig.10GraphofthenumberofRGCinthedetachedandattachedretina2.4II 一 1Ra 及 IL 一 1B 抗体的神经保护作用注入 10ngIL 一 1Ra 和 500ngII 一 1G 抗体后,视网膜脱离 1d 时 RGC 的存活数为 (1701439)个/mm.(一 10),(1257279)个/mm(一 10),10d 时为(902156)个 /mm.(一 12),(730131)个/mm(一l1).分别与单纯视网膜下注入 healonGV 后 1d(791128)个/mm.,一 12和 10d(804131)个/mm.,一 10时的
21、 RGC 数相比,IL 一 1Ra,IL1B 抗体的注入在 1d 内可以减少 RGC 的死亡(t 一9.971,P 一 0.000;t 一一 6.0145,P:0.0001).而10d 后这种作用减弱(t=3.352,P 一 0.002;t=1.366,P 一 0.9064)3 讨论通过对 SD 大鼠脱离的视网膜进行 RGC 计数发现,随着视网膜脱离时间的延长,脱离区的 RGC 存活数呈进行性下降.RGC 的丢失从脱离后 2h 就开始,24h 时达到高峰,然后呈缓慢的下降趋势.在视网膜脱离对侧的未脱离区(不是脱离的边缘),RGC 的丢失随脱离时问的延长而缓慢增加.这和 Faude 等在兔视网膜
22、脱离部位的边缘区发现的 RGC 及 RGC 轴索的丢失相似.这同时也和 Sasoh 等的多中心的研究发现一致,他们发现不论是在脱离区还是未脱离区,都有明显的视网膜电图改变.视网膜脱离 10d 后复位(早期复位)的视网膜RGC 的死亡可以停止在复位前的水平上;而视网膜脱离 90d 后复位(晚期复位) 则不能使其完全停止,RGC继续丢失,然后停止在某一阶段上.说明早期复位对视网膜脱离来讲,可以重建视细胞层正常的血氧供给,重建了细胞与细胞,如 RPE 与锥杆细胞,锥杆细胞与MUller 细胞问的相互作用,逆转由视网膜脱离所引起的级联反应 L8,进而停止 RGC 的丢失.而晚期复位则不能完全迅速停止某
23、些反应,或者是在复位过程中的损伤修复反应对 RGC 也有损害 .利用 IL1Ra 与 IL1 受体 I(IL 一 1RI)结合后不引起任何效应这一特点来直接抑制炎性反应,用 II1B抗体直接和 IL1 结合,阻断 II 一 1B 与 IL 一 1RI 的结合,问接抑制炎性反应.我们发现,IL 一 1Ra 和 II 一 1G 抗体对 RGC 有保护作用 .而 10d 后这种作用减弱,这与长时间的脱离状态下,小剂量的 IL 一 1Ra 和 IL 一 1G 抗体不能完全拮抗炎性反应有关.同样也证实了视网膜脱离后所诱导的 II 一 1B 是导致 RGC 丢失的重要因素之一 .因此,脱离区和非脱离区 RGC 的丢失是成功复位术后视力缺陷的主要原因.视网膜脱离诱导的 II 一 1B 是RGC 丢失的关键 .4 参考文献一一一一一一一一一一一一一一一一一
