1、地衣芽孢杆菌 ws-6 产纤维素酶条件优化2009 年 19(5)生物技术18陆康德.微生物源食品防腐剂开发眺望J.开发展望,2009,16(3):56.191 郝林华 ,陈靠山,牛德庆,等.粘质沙雷氏菌(Serrat/a 一)发酵培养基优化的研究J.海洋科学进展,2006,24(1):6673.2o闵涛玲,杨启银 ,曩潇潇,等.光合细菌菌剂中一株粘质沙雷氏茵的分离与鉴定J.安徽农业科学,2006,34(22):58375838.5921孙敏,姚日生 ,尤亚华,等.粘质沙雷氏菌酶促过氧化氢降解对氨基苯酚的研究J.环境化学,2006,25(2):141144.22刘家玉,赵志强 .粘质沙雷氏菌菌
2、苗治疗银屑病J.中国麻风皮肤病杂志,2001,17(3):224.23t 庆蓉,靳小青 ,吴念曾 .粘质沙雷氏菌治疗脑神经胶质细胞瘤的疗效观察J.海军医学杂志,2O07,28(4):315 317.地衣芽孢杆菌 WS 一 6 产纤维素酶条件优化詹发强,包慧芳“,王炜,崔卫东 ,龙宣杞,杨蓉,林瑞峰(1.新疆农业科学院微生物应用研究所,新疆乌鲁木齐 830091;2.新疆特殊环境微生物工程技术中心,新疆乌鲁木齐 830091)摘要:目的:通过优化该菌产酶条件,以期在饲料中的进一步应用建立基础.方法:纤维素酶活性用还原糖法测定,产酶条件采用单因素筛选与正交优化方法相结合.结果:培养基初始 pH6.
3、5,培养温度 37,接种量 2%,250mL 三角瓶装液量 30rnL,葡萄糖 1.5%,羧甲基纤维素钠 0.5%,酵母膏 1.5%,KH219040.05%,NaC10.5%,培养 48h后酶活性达到最高 3.45U/mL;金属离子K,M,M,z,c,Na 对产酶有激活作用,cu2 则抑制酶活性.结论: 酶活性比出发菌提高约1.4 倍,对饲料制作中提高纤维降解具有一定的实用价值.关键词:地衣芽孢杆菌;纤维素酶;优化中图分类号:Q935;Q814 文献标识码:A 文章编号:1004 31x(2oo9)o5005903OptimizationofCellulaseProductionCondit
4、ionsforBacillusLichenformisws 一 6ZHANFaqiang,BAOHuifang,WANGWei“,CUIWeidong,L0NGXuanqi,YANGRong一,LINRuifen(1.1nstiteofMicrobiologyofXinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Umql830091;2.XinjiangResearchCenterofMicrobialEngineeringofSpecialEnvironmental,Ummqi830091,China)Abstract:Objective:Todevelopfurt
5、her 印pcafioninthefeedbyoptimifingtheproductionconditionsofceHulaseproducedbyBacillusLicheni 一觚 ws 一6.Method:CeUulaseactivitymeasLuedbyreducingsugarcontent,conrbindedwithsinglefactortestandorthogonaloptimizationto 叩一timizetheproductionconditionsofceUulase.Result:Themaximumactivitywasrecordedafter48hw
6、henculturedin1.5%l 脚 se,0.5%c.arboxymethylcellulosesodiuln,1.5%yeastextract,0.05%KH2PO4and0.5%Naa,with2%inoculationnoant,mediumvolulne30mL/flask(250mL),theimtipHwas6.5,thetemperaturewas37%.MeanwhilethestudiesshowedthatNa,K,Mn2,Md,Zd,ccouldac.tivetheenzyme,butCu2inhibitedit.Conclusion:Thecellulaseact
7、ivitywasimproved1.4timescomparedtooriginalbacteria,meanwhileithascertainpracticalvaluetoimprovefiberdegradationduringthefeedmakingprocess.Keywords:Bacilluslicheniformis;celluhse;optimization随着养殖业的迅猛发展,饲料行业面临资源短缺的状况愈来愈突出,如何高效利用这一资源已显得尤为迫切 l.农作物秸秆在自然状态下是一种劣质粗饲料;若经微生物处理,则能明显提高其营养价值,提高秸秆转化利用率,是畜牧业健康可持续发
8、展的重要途径.地衣芽孢杆菌作为一种益生菌具有以下优良特性,能调节动物肠道菌群平衡,增强细胞免疫和体液免疫功能,提高机体免疫力,促进养分的消化吸收 b】.在作为鸡饲料,奶牛饲料,鱼饲料添加剂和仔猪添加剂方面都具有很好的作用效果.本研究中的地衣芽孢杆菌能够产纤维素酶,在较低的 pH 值条件下生长良好 ,且兼性厌氧|l,所以在青,黄贮饲料制作中对于提高饲料利用率,纤维素分解率以及保持动物肠道微生态平衡都具有很高的应用价值.本研究通过对此株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌 ws 一 6 进行研究,初步优化和探索了其产酶条件,为此株细菌在饲料中的进一步应用建立基础,也为进一步改造,构建更适合生产纤维素酶的工程菌
9、株奠定了理论和试验基础.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料菌株来源于从新疆乌苏本地多年青贮窖中分离筛选到的地衣芽抱杆菌(BacillusLieheniformis)ws 一 6 菌株,现保存于中国收稿日期:20090302;修回日期:2OO90427基金项目:国家“973“计划项目(“秸秆资源生态高值化关键过程的基础研究“,2004CB719704);新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划项目(“微生物青黄贮菌剂的分子改良应用“,2005111o7)资助.作者简介:詹发强(1980 一),男,学士,助理研究员,研究方向:微生物发酵工程,Email: 面 xi126.cotn;*通讯作者
10、:王炜(1965 一),男,研究员,研究方向:微生物工程,Email:Mmngwei0718126.corn.普通微生物保藏管理中心:编号 CGMCCNo.1991.1.1.2 试剂蛋白胨,酵母膏,琼脂等购自北京奥博星生物技术有限责任公司,葡萄糖,蔗糖,NaC1,NaOH,MgSO,?7H20 等购自天津市天新精细化工开发中心,盐酸,乙醇购自中国医药集团上海化学试剂公司,羧甲基纤维素钠购自 Sigma 公司,其余试剂均为分析纯.1.1.3 仪器E360K 离心机( 德国 Eppendof);紫外分光光度仪 UV 一 2550(日本岛津自动化设备有限公司),MLS 一 3020 高压蒸汽灭菌锅(
11、新德医疗器械有限公司);DK 一 8D 电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);pHs 一 3C 酸度计(上海雷磁仪器厂 );AEL一160 岛津电子天平(日本岛津自动化设备有限公司);摇床ZI-1WY 一 100D(上海智城仪器制造有限公司).1.1.4 培养基(1)斜面保存培养基蛋白胨 1Og,氯化钠 lOg,酵母粉 5g,水 1O00mL,琼脂粉15g,pH6.5,1x1Pa 灭菌 25min.(2)种子培养基蛋白胨 10g,氯化钠 10g,酵母粉 5g,水 1000mL,pH6.5,1x105Pa 灭菌 25min.(3)基础产酶培养基蛋白胨 10g,酵母膏 10g,CMCNa10g
12、,NaC15g,KH2POlg,蒸馏水 1000mL,调 pH 至 6.5,1x105Pa 灭菌 25min.1.2 方法1.2.1 菌种活化将分离保存的地衣芽孢杆菌(Bacillus 咖)ws 一 6菌株转接到斜面培养基,37C 培养 24h,备用.1.2.2 种子液的制备生物技术取一环活化的菌种,接入装液量为 50mL 种子培养基的25OraL 三角瓶中,37,200rlmin 培养 18h.1.2.3 发酵培养取 lmL 种子液,接人盛有 50mL 基础产酶培养基的 25Oral三角瓶中(接种量为 2%,v/v),置 37摇床中振荡培养 ,转速删 rain.1.2.4 粗酶液制备取发酵液
13、 lmL,5000amin 离心 10rain,取上清液即为粗酶液.1.2.5 羧甲基纤维素酶(CMC 酶)活力测定参照 NY/T9122004 测定饲料添加剂纤维素酶活力.酶活定义:在温度 5o,pH6.0 条件下,每分钟由底物降解释放 ltanol 还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U).2 结果和分析2.1WS 一 6 菌株发酵产酶条件优化2.1.1 初始 pH 和培养温度对产酶的影响在基础产酶培养基的基础上,以 2mol/L 的盐酸或 3mol/L氢氧化钠调节培养基初始 pH4.08.0,培养 24h 后测定酶活.结果(图 1)显示,初始 pH5.57.5 有利于 WS 一 6 菌株
14、产酶,酶活在初始 pH6.5 时最高,这说明中偏酸性环境有利于菌株产酶.在 2550范围内恒温振荡培养,结果(图 2)3540的培养温度有利于菌株产酶.图 1 初始 pH 值对产酶的影响Fig.1InfluenceofinitialpHonCrdCaseproduction墨圈 2 培养温度对产酶的影响Fig.2Influenceofthetenrature0nCilCaseproduction2.1.2 装液量对产酶的影响在 250mL 的三角瓶中分别装入 10mL,20mL,30mL,40mL,50mL 和 60mL 培养基,接种后培养 24h 时取样测定酶活力.装液量对菌株产酶水平的影响
15、表明,当培养基装液量由 10mL 增加到 30mL 时,产酶能力增加,但继续提高装液量则使菌体产酶水平下降.这说明菌株产酶水平与菌体生长并不完全一致,并非菌体生长量越大产酶水平越高.溶氧水平对菌株产酶具明显得影响,结果如图 3,在装液量为 30mL 时表现较高的产酶活性.2.2WS 一 6 茵株发酵产酶培养基优化2.2.1 不同碳,氮源对产酶的影响在上述培养条件下,以基础产酶培养基为基础改用不同碳源:1%葡萄糖,1% 蔗糖,1% 羧甲基纤维素钠,0.5% 葡萄糖+0.5%羧甲基纤维素钠,0.5%蔗糖+0.5% 羧甲基纤维素钠,考查不同碳源对 W 舄一 6 菌株产酶的影响.结果见图 4.葡萄糖最
16、有利于产酶,0.5%葡萄糖和 0.5%羧甲基纤维素钠产酶水平远高于前述碳源;在基础产酶培养基的基础上采用不同氮源(添加量 1%),结果如图 5,最佳氮源为酵母膏.2.2.2 金属离子对酶活性的影响2O09 矩 19(5)在产酶培养基中分别加入 0.05%的,c,Fe2,M,Zn2,c02,ca2,Na,K 不同金属离子,接种后培养24h 时取样测定酶活力,结果如图 6 所示.金属离子,K,Mn2,M,Zf12,c02 对菌株 W86 产酶有促进作用,而,ca2 对菌株 ws 一 6 产酶没有显着影响,cu2 则抑制菌株产酶.1.81.6蓄 i 鼍 1主 0Mediumvolume(mL)图 3
17、 装液量对 ws 一 6 菌株产酶的影响Fig.3Influenceofthe/l-iIllmvolume011CMC 衄 eproductionby.觑耐?for.WS 一 643.5;藿2 蔓21.51喜.害CarbonIolll-ces图 4 不同碳源对 WS 一 6 菌株产酶的影响Fig.4Influences0fthedifferentcarb0Ilsool013esOlltheactivityofcellulaproducedbyB.1icheniformisws 一 6inliquidcultures_.1II. 工摹乏1.1.TT 耋.工.,.-.,f,ITlJo 薹2OO9
18、年 19(5)生物技术株的最佳培养基配方为葡萄糖 1.5%,羧甲基纤维素钠 O.5%,酵母膏 1.5%,KI-I2P040.1%.表 1 正交优化实验因素水平Table1Factoanddataofthelevelsinorthogonallist表 2 产酶培养基优化正交实验结果.Table2ResultstheorthogonalexperimentforoptimizedcompositionofthemediumforCMCaseproduction2.2.4 优化后酶活性变化在最佳碳,氮源,最适 pH 和发酵温度条件下,30n 讧 J 最优发酵培养液中接入 2%的种子菌液,地衣芽孢杆
19、菌 Ws 一 6 菌株酶活性动态变化如图 7 所示.在培养 12h 后可检测到纤维素酶活性,产酶高峰发生在第 48h,达 3.45U/mL,此后 8h 产酶水=:r4喜=薹 2.喜.812l62024283236404448525660Time)图 7ws 一 6 菌株酶活曲线Fig.7cMc8seactivityCllle0fBad/usorm/sW866l平急剧下降.3 讨论3.1 对 ws 一 6 产纤维素酶条件进行了优化,发现初始 pH 值和培养温度是影响 ws 一 6 菌株发酵产酶水平的重要因素,发酵产酶最适初始 pH 值为 6.5,最适培养温度为 37.发酵中的溶氧水平对产酶有显着
20、影响,251N三角瓶中以装 3Oral 培养基为宜;同时酶的活性受金属离子的影响,金属离子 Na,K,Nn2,M,c02 对菌株 ws 一 6 产酶有促进作用,而,cd 对菌株 wS 一 6 产酶没有显着影响,cu2 则抑制菌株酶活性.3.2 采用正交实验设计分析对地衣芽孢杆菌 ws 一 6 菌株产酶培养基进行优化,确定怕一 6 菌株产酶培养基组分为(L):葡萄糖 15g,羧甲基纤维素钠 5g,酵母膏 15g,KH2PO40.5g,NaC15g,同时发现纤维素酶的产生与菌体生长部分藕联,菌体生长量在 24h 达到最大,而 ws 一 6 菌株产酶水平在 4gh 时达到最高,酶活性达到 3.45U
21、/mL,比出发菌酶活性提高约 1.4 倍.3.3 由细菌所产生的纤维素酶一般为中性或偏碱性“,ws 一6 菌株所产纤维素酶具有一定的耐酸性,且在弱酸性条件下活性相对较高,所以在青,黄贮饲料制作中对于提高纤维素分解率以及饲料的利用率都具有较高的应用价值.参考文献:1王新峰,张金成 ,李海英,等.纤维素酶对粗饲料人工瘤胃 pH,氨态氮及产气量的影响J.中国饲料,2006,20:2226.2朱军莉,韩剑众 ,励建荣.纤维素分解菌 BSX5 的分离,鉴定及产酶条件J.食品与生物技术,2006,25(3):1518.3韩鲁佳,刘向阳 ,阎巧娟,等.我国秸秆饲料资源开发利用的研究J.农业工程,1997,1
22、3(1):120 124.4王建平.纤维素酶的研究进展及趋向J.中国微生态学杂志.21702,14(4):308309.5荆忠良,张海峰 ,王振平,等.微生态制剂的研究进展及其在畜牧生产中的应用J.山东畜牧兽医,2007,3o(3):5051.6刘连成,沈标 ,陆健,等.地衣芽孢杆菌碱性果胶酶基因 PelA 的克隆与原核表达【J.工业微生物,2008,38(1):2129.7蒋若天,宋航 ,陈松.一株产 n 一高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌的分离和筛选J.工业微生物,2007,37(3):3741.8唐娟,张毅 ,李雷雷,等.地衣芽孢杆菌应用研究进展j.湖北农业科学,2008,47(3).35135
23、4.9曹煜成,李卓佳 ,冯娟,等.地衣芽孢杆菌胞外产物消化活性的研究J.热带海洋,2005,24(6):6 11.1o刘晓琳,陈乐超 ,余新京,等.地衣芽孢杆菌对断奶仔猪生产性能的影响J.广东饲料,2OO8,17(1):2728.【l1胡爽,王炜,詹发强,等.一株产纤维索酶细菌的筛选鉴定 J.生物技,2OO8,18(5):3638.12高凤菊,陈惠 ,吴琦.产纤维素酶芽孢杆菌 C 一 36 的分离筛选及其鉴定J.四川农业大学,20116,24(2):175177.产脂肪酶粘质沙雷氏菌发酵产酶条件的优化朱绮霞,张搏,陆雁,王青艳,黄日波(广西科学院国家非粮生物质能源工程技术研究中心,广西南宁 5
24、30(107)摘要:目的:通过对产脂肪酶粘质沙雷氏菌发酵条件的优化,使其酶活力得到大幅度提高.方法:用响应面法对产脂肪酶粘质沙雷氏菌的发酵产酶培养条件进行了优化.首先通过逐因子实验考察了该菌株产酶所需的最适碳源和氮源,在此基础上通过Plackettburman 法设计实验,考察了几种因素对产酶影响的大小,然后用最陡爬坡实验逼近以上几种因子的最大响应区域后,采用 BoxBehnken 设计 25 组实验,并利用 DesignExpert 对实验结果进行二次回归分析.结果:对产酶具有显着效应的 4 个因素为:蛋白胨,Caa2,吐温,大豆油 .实验优化到最佳的产酶条件为:糊精 l%,蛋白胨0.7%,CaQ20.3%,吐温一 801.68%,大豆油1.81%,HPo.0.05%,MgSO,0.05%,FeSO40.1%.结论:优化后发酵液上清的脂肪酶活力可达 97.52U/ml,比优化前提高了 lO倍.关键词:脂肪酶;枯质沙雷氏菌;响应面;发酵;优化中图分类号:Q939.97 文献标识码:A 文章编号:1004 311x()o5006105OptimizationofFementafionConfiomforProducingLipebySerratia,lltrlcescensZHUQixia,ZlLGBo,LUYah,GQingyan,HIJANGPdb0
