1、细菌菌壳作为免疫佐剂的研究进展 居自远 钱晶 徐小洪 卜朝阳 郎需龙 王兴龙 南通濠河旅游园景建设有限公司 军事医学科学院军事兽医研究所 吉林大学动物医学学院 江苏省农业科学院兽医研究所 摘 要： 细菌菌壳 (Bacterial ghosts, BGs) 是一种不含细胞质和核酸成分的细菌空壳。近年来, 研究证实 BGs 表面保留了大量完整的天然免疫模式识别受体的激动剂, 可作为免疫佐剂诱导机体免疫或非免疫细胞分泌细胞因子, 进而激活适应性免疫应答。除此之外, BGs 还可装配蛋白和核酸以提高外源抗原的免疫原性。主要介绍了 BGs 制备技术、佐剂效应机制以及应用潜能的最新研究进展。关键词： 细菌
2、菌壳; 制备技术; 免疫佐剂; 应用潜能; 作者简介：居自远 (1986) , 男, 江苏南通人, 助理兽医师, 从事野生动物临床诊疗研究。作者简介：钱晶, 助理研究员, 从事动物及人兽共患传染病研究。收稿日期：2017-08-28基金：国家公益性行业 (农业) 科研专项“宠物疫病快速诊断与疫苗研究与示范” (201303042) Advancement in Bacterial Ghost Application as Immune AdjuvantsJU Zi-yuan QIAN Jing XU Xiao-hong Nantong Hao River Tourism Landscape C
3、onstruction Ltd; Institute of Military Veterinary Medicine, Academy of Military Medical Sciences; Abstract： Bacterial ghosts ( BGs) are a group of hollow bacterial envelopes containing neither cytoplasm nor nucleotide contents. BGs are proved to retain large amounts of intact ligands of pattern reco
4、gnition receptors, which functions as adjuvants to induce proinflammatory cytokine production by immune and non-immune cell. These cytokines will further assist the activation of adaptive immune response. In addition, proteins and nucleotides can also be equipped into BGs to achieve elevated immunog
5、enicity. In this review, recent advances in BGs production, adjuvant function mechanisms and new applications were discussed in detail.Keyword： Bacterial ghosts; Preparation techniques; Immune adjuvants; Application potential; Received： 2017-08-28早在 1982 年, Henrich B 等1就已经发现大肠杆菌噬菌体裂解酶可使大肠杆菌裂解死亡并且在电镜
6、显示下呈现鬼影 (Ghosts) 模样, 并进一步证实其中的裂解 E 蛋白具有在细菌细胞膜上打孔的功能, 其被命名为 Bacterial Ghosts (BGs) 。我国于 2004 年才开始有 BGs 的研究报道, 有专家学者将其意译为细菌菌影、菌蜕或菌壳2-4。如今的 BGs 是由噬菌体 phi X174 裂解 E 蛋白作用革兰氏阴性菌细胞膜后而形成的细菌空壳形态5。电镜下的 BGs 展现了其完整结构, 如外膜蛋白、黏附素、脂多糖和肽聚糖等6, 保留了细菌表面的有效抗原表位, 可作为新型灭活细菌预防细菌性传染病。目前, 已制备了多种不同革兰氏阴性菌菌壳并证实其具有良好的免疫原性4,7-25
7、, 而随着 BGs 研究的深入, BGs 介导的免疫佐剂效应机制以及新型载体递送平台的应用也越来越受到研究人员的关注26。该研究主要介绍了 BGs 的制备技术、佐剂效应机制以及应用潜能的最新研究进展。1 细菌菌壳的制备技术目前, BGs 的制备技术已应用于多种革兰氏阴性菌, 如大肠杆菌7,14,23,27、沙门氏菌12,18-19,25、布鲁氏菌4,8,28-29、维氏气单胞菌15、霍乱弧菌20、克雷伯氏菌13、副猪嗜血杆菌13,17、胸膜肺炎放线杆菌16,21、迟缓爱德华菌24、多杀性巴氏杆菌22、柱状黄杆菌11等, 均可达到可观的裂解效果, 通常再采取反复冻融或高渗溶液处理即可获得细菌菌壳
8、, 以此作为非变性灭活菌苗相比传统甲醛灭活菌苗具有理想的免疫原性。BGs 的制备主要基于噬菌体 phi X174 裂解 E 基因的表达, 在细菌的两极或中部形成 12 个直径为 40200 nm 的跨膜孔道5, 通过温控敏感部件 c I857 阻遏蛋白在常温 28及以下可抑制 E 基因的表达, 通过提高培养温度致使阻遏蛋白失活, 进而促使裂解酶发挥活性。这通常依赖特定或广宿主重组质粒的导入进而诱导目的基因的表达。吴幼27基于蓝白斑筛选技术将裂解 E 基因插入大肠杆菌 Lac Z 序列中, 利用菌落颜色筛选获得非智力依赖性的菌壳株。钱晶等4,30采用同源重组技术经正、负向筛选后将温控裂解部件插入
9、犬布鲁氏菌基因组中的 B0419 基因, 通过 42诱导表达获得非质粒依赖型的布鲁氏菌菌壳;与此同时, 付立霞10采用同源重组技术制备获得嗜水气单胞菌菌壳。上述 2种菌壳制备技术克服了过去依赖抗性标记质粒表达的局限性, 如抗生素抗性基因的残留和重组质粒的遗传不稳定等因素。另外, 管玲玉31报道了一种营养诱导型的裂解系统, 即通过限铁诱导启动子 Pviu B控制裂解 E 基因的表达效率, 最终基于该系统制备了鳗弧菌菌壳。除了通过裂解 E 基因表达系统以外, 胡本钢13采用抗菌肽配合超高压装置, 分别制备了副猪嗜血杆菌菌壳和肺炎克雷伯氏菌菌壳, 其免疫原性均优于常规灭活菌苗。然而, 无论是采用基因
10、工程手段还是物理化学方法制备菌壳, 其目的都是获得完整的细菌空壳, 这是保证细菌本身的免疫原性及其表面免疫激动分子功能活性的重要前提。2 细菌菌壳作为佐剂的作用机制免疫佐剂通常是通过刺激宿主机体免疫细胞表面的天然免疫受体进而增强疫苗的免疫原性32。其中, 天然免疫细胞通过一系列模式识别受体, 如 Toll 样受体 (TLR) 识别细菌、病毒、寄生虫以及霉菌感染等多种刺激进而介导免疫应答反应33。例如 TLR2/4 识别细菌脂多糖 (LPS) 和脂磷壁酸质 (TLR-2/4) 、TLR9 识别 Cp GDNA、TLR5 识别鞭毛蛋白等34-36。近些年, 细菌的某些成分具有增强弱抗原性疫苗的免疫
11、应答能力, 已经被应用到疫苗的研制当中。BGs 的产生属于非变性, 保留了完整的细胞膜和细胞壁结构, 这其中包含已知的免疫刺激成分 (LPS、鞭毛等) , 是一类十分有潜力的高效免疫佐剂6,37。BGs 的这些胞外结构能够有效地被免疫细胞或非免疫细胞所识别与递呈38, 主要通过 TLR2 和 TLR4 信号通路激活免疫细胞, 包括诱导树突状细胞 (Dendritic cells, DCs) 的活化与成熟, 进而促使其向淋巴器官 T 细胞区域的募集;BGs 通过 TLR2 和 TLR4 接头分子经依赖 My D88 或 TRIF 途径 (非依赖 My D88) 将信号传递给下游 MAPK 或 I
12、k B 级联分子, 激活核内转录因子, 如 NF-k B、AP-1、IRF3/7, 最终产生各种促炎细胞因子和趋化因子等39-41。DCs 作为专职的抗原递呈细胞, 能有效摄取和加工 BGs, 介导促炎细胞因子的产生, 随后上调 DC 细胞的共刺激因子表达, 进而有利于将外源抗原高效地递呈给未致敏 T 细胞42-43。研究发现 BGs 能向 DCs 提供有效的早期成熟信号, 大量分泌 Th1 细胞因子 (特别是 IL-12) , 进而激活 NK 和 Th1 细胞43。另外, 在DCs 接触 BGs 12 h 后, DCs 表面 MHC-II 的表达水平显著上调42-43, 表明BGs 具有激发
13、早期免疫应答反应的潜力, 这对于紧急免疫接种策略或许又是一个新发现。不仅如此, BGs 的 LPS 还能够增强 DCs 细胞 MHC-I 的表达, 使 DCs将抗原多肽交叉递呈给 CD8+T 细胞, 从而有助于诱导有效的细胞毒性 T 细胞应答44-45。菌壳能够上调 DCs 表面细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) 的表达, 这为激发高效 CD8+T 细胞反应提供必要基础46。研究发现沙门氏菌 BGs 和肠炎沙门氏菌 BGs 均引起有效的 CD8+T 细胞应答, 并保护免疫的禽免受致死性剂量强毒株的攻击18-19。除了能够作用于 DC 细胞, BGs 也能有效地激活单核细胞和巨噬细胞, 并且能
14、促进免疫反应趋向 Th1 型应答发展47。此外, BGs 诱导许多淋巴和非淋巴细胞产生细胞因子和趋化因子, 促使 T、B 淋巴细胞和免疫细胞向淋巴结的回流和迁移, 从而充分与同源抗原接触激发免疫应答。这些结果表明 BGs 的自身免疫佐剂效应使其能有效地诱导机体产生体液免疫及细胞免疫反应。BGs 也可以刺激非专职抗原递呈细胞, 如结膜上皮细胞、成纤维细胞、角蛋白细胞、黑色素瘤细胞等38,48-50。因此, BGs 能够提供非特异性的抗病原微生物的能力, 并且 BGs 也能利用 TLR5 分子 (识别鞭毛) 激活下游信号通路。Abtin 等发现野生型大肠杆菌 (NK9373) 的菌壳比突变的无鞭毛
15、大肠杆菌菌壳更容易被角蛋白细胞所捕获48, 这表明细菌鞭毛蛋白能够通过 TLR5 或炎症小体介导细胞活化途径进而激活任意一种信号通路51。另外, BGs 还能作用于淋巴细胞。利用放线杆菌 BGs 体外刺激 T 细胞以后, 能够检测到特异性的 T 细胞应答反应。Felnerova 等52研究结果也表明, BGs 能够诱导 T 细胞增殖, 并且在抗原递呈细胞的辅助下其激活 T 细胞增殖能力强于单独 BGs 刺激组。因此, BGs 不仅可以通过抗原递呈细胞活化 T 细胞, 还可以通过 TLR 分子直接活化 T细胞。目前, BGs 作为免疫佐剂的最大原因主要是包含 LPS。Means 等53研究发现,
16、 经过鞭毛处理的 DCs 相比 LPS 处理的 DCs 具有较弱的递呈 T 细胞能力, 但也能介导 T 细胞分泌细胞因子。Jawale 等54研究发现含有大肠杆菌热不稳定 B 亚基肠毒素的沙门氏菌 BGs 比单独 BGs 具有更有效地诱导体液和细胞免疫应答的能力。3 细菌菌壳的应用潜能大多免疫细胞或上皮细胞普遍表达 TLR4 和 TLR5, 作为其配体的 LPS 和鞭毛在BGs 上固有存在, 这使得 BGs 能够有效地诱导黏膜免疫应答。BGs 本身的佐剂属性使之成为潜在的载体平台, 可在其表面装配外源蛋白或在其内部装载 DNA 片段。另外, BGs 的靶向性也使其成为装载小分子药物的良好载体2
17、6。目前, 已报道用于装载 DNA 疫苗的 BGs 有溶血性曼氏杆菌 (Mannheimia haemolytica, M.haemolytica) 和伤寒沙门氏杆菌 (Salmonella typhi, S.typhi) 47。Ebensen 等42于 2004 年证明在 M.haemolytica BGs 中装载DNA 可显著增强 APC 对 DNA 的摄取, 且能诱导更强的特异性体液和细胞免疫反应, 并使初始型 Th 细胞向 Th2 型细胞分化, 这有利于机体消除持续性感染。另外 S.typhi Ty21a BGs 可以协助 HIV gp140DNA 被小鼠巨噬细胞 RAW264.7 吞
18、噬, 在体内试验中诱导小鼠产生更好的黏膜免疫反应, 这对 HIV 疫苗的研制具有重要的意义55。然而, BGs 作为蛋白载体平台的应用更为常见, Chan 等56在 S.typhi BGs 表面分别表达产肠毒性大肠杆菌 (enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 的菌毛蛋白 K88ab、K88ac、K99 和 Fas A, 该嵌合 BGs 免疫小鼠后 14 d, 血清Ig G 和粪便 Ig A 都有显著上升, 且肠道抗原特异性 B 淋巴细胞、脾脏淋巴细胞均有显著上升。Cai 等57在 E.coli 外膜表面表达线性 Stx2Am-Stx1B, 该嵌合 BG
19、s 不仅能诱导更高水平的血液 Ig A 或 Ig G, 还较单独 BGs 组提供更好的免疫保护效果。通过黏膜免疫途径对机体进行免疫是当前黏膜疫苗研究的热点, 但由于缺乏通过此途径激发足够有效的免疫原, 因此一直处于瓶颈阶段。BGs 作为候选疫苗的一大优势就在于其能够引起有效的抗原特异性黏膜免疫和系统性免疫反应26,57。其中以幽门螺旋杆菌为载体的口服疫苗研究尤为突出, Talebkhan 等58在幽门螺旋杆菌 BGs 表面装载了其自身的一种保护性抗原 Omp18 蛋白, 经口服免疫小鼠后, 小鼠产生高水平抗 Omp18 抗体, 另外还发现活的幽门螺旋杆菌在胃部的数量也显著减少。BGs 这类微小
20、颗粒同样易于被抗原递呈细胞摄取, 因此也常被用作装载酶类、抗生素、抗肿瘤药物26,37,42。研究表明, BGs 装载的酶类仍具有其酶活性, 通过装载特定的酶类, BGs 不但有助于治疗酶类缺失造成的代谢紊乱, 还能通过装载带有偏嗜性的酶类调节肠道菌群59。除此之外, Paukner 等60成功借助 M.haemolytica BGs 装载抗肿瘤因子 doxorubicin (DOX) , 使其靶向人结肠腺癌细胞, 其抗癌效果显著优于单独使用 DOX, 并未对健康细胞造成病理性损伤。由此可见, 保留了细菌生物学活性的 BGs 的应用潜能在不断被挖掘。4 展望BGs 是一类具有良好安全性和免疫原
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