1、灵芝三萜液态深层发酵的研究进展 翟双星 冯杰 冯娜 唐庆九 周帅 杨焱 刘艳芳 张劲松 上海市农业科学院食用菌研究所/国家食用菌工程技术研究中心/农业部南方食用菌资源利用重点实验室/国家食用菌加工分中心/上海市农业遗传育种重点开放实验室 上海师范大学生命与环境科学学院 摘 要： 三萜类化合物是灵芝中主要的活性化学成分之一, 由于其具有多种生理活性, 现已成为灵芝研究开发的热点。为了给灵芝三萜液态深层发酵的调控及未来的规模化生产提供参考和借鉴, 本研究聚焦通过发酵工程手段获得灵芝三萜的最新研究工作, 综述了灵芝发酵方法中三萜的检测方法、发酵技术、液态深层发酵动力学及与灵芝三萜生物合成相关途径等方
2、面的研究进展。在此基础上指出了研究中存在的问题:没有系统性地筛选适合发酵工程生产的灵芝三萜菌株, 缺乏对菌丝体中三萜的化学结构和药理活性方面的研究, 目前只有较少规模化的利用发酵法生产灵芝三萜的研究, 缺少直接利用活性追踪的方法优化灵芝三萜生产工艺等, 最后进行了展望。关键词： 灵芝; 发酵; 发酵动力学; 生物合成; 作者简介：翟双星, 女, 1993 年生, 安徽宿州人, 硕士研究生, 研究方向:生物化学与分子生物学生物药物学。通信地址:201403 上海市奉贤区南桥镇金齐路 1000 号上海市农业科学院食用菌研究所 413, Tel:021-37196810, E-mail:。作者简介：
3、冯杰, 男, 1983 年生, 安徽蚌埠人, 副研究员, 研究生, 博士, 主要从事食药用真菌的发酵技术调控和改良。通信地址:201403 上海市奉贤区南桥镇金齐路 1000 号上海市农业科学院食用菌研究所, Tel:021-62201203;E-mail:。作者简介：张劲松, 男, 1969 年出生, 研究员, 博士, 研究方向:药用真菌活性物质化学结构、生物活性和发酵过程。系统的研究了中国栽培灵芝的多糖、三萜的化学结构和生物活性, 发现了具有激活 B 细胞糖肽 GLIS 和具有抑制前列腺增生效果的灵芝三萜成分。通信地址:201403 上海市奉贤区南桥镇金齐路1000 号上海市农业科学院食用
4、菌研究所 109, Tel:021-62200754;E-mail:;。收稿日期：2017-11-27基金：基金项目:灵芝抑制前列腺增生功能因子关键制备技术的研究 (沪农科攻字 (2016) 第 5-4 号) Research Progress on Ganoderma triterpenes Obtained by Liquid Submerged FermentationZhai Shuangxing Feng Jie Feng Na Tang Qingjiu Zhou Shuai Yang Yan Liu Yanfang Zhang Jingsong Institute of Edibl
5、e Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, National Engineering Research Center of Edible Fungi, Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization (South) , Ministry of Agriculture, P.R.China, National RKey Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai; Abstract： Trite
6、rpenes are one of the main active chemical components in Ganoderma, and it has become thehotspot in current research due to multiple physiological activities. In order to provide a reference for the liquidsubmerged fermentation regulation of Ganoderma triterpenes and large-scale production, we focus
7、 on therecent latest research of Ganoderma triterpenes produced by fermentation engineering. In addition, the progressof the detection method of triterpenes, fermentation technology, fermentation kinetics, and the triterpenesbiosynthesis pathway was reviewed. On this basis, the problems in research
8、were as follows: we had notscreened Ganoderma triterpenes strains systematically suitable for the fermentation production, we lacked thestudy of triterpenes chemical constitution and pharmacological activity, there was only less study on the Ganoderma triterpenes large-scale production by fermentati
9、on, and we lacked the production engineering of Ganoderma triterpenes optimized by activity tracking. At last, the progress was forecasted.Keyword： Ganoderma; Fermentation; Fermentation Kinetics; Biosynthesis; Received： 2017-11-270 引言灵芝又名瑞草、灵芝草, 属多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体, 是中国著名的药用真菌, 最先记载于神农本草经, 具有扶正固本、滋补强
10、壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。已有研究表明, 灵芝中含有多种活性成分, 如多糖、三萜、甾醇、氨基酸、蛋白质、生物碱、挥发油、维生素及无机元素等1。现如今对于灵芝中的化学成分研究重点主要集中有不同生物活性的三萜和多糖的上。目前, 市场上灵芝多糖相关产品种类丰富, 因为灵芝中三萜成分复杂难以制备, 导致灵芝三萜类的相关产品较为缺乏, 因此吸引许多研究者将注意力集中到灵芝三萜化合物的研究上来。目前, 获取灵芝三萜的来源主要有两种:一是从栽培生产出的子实体和灵芝孢子中获取, 二是从发酵生产出的菌丝体或发酵液中获取。由于栽培生产灵芝的周期较长 (一般需要 49 个月) , 并且易受环境与季节的影响,
11、 导致从子实体中准备的三萜产品的稳定性较差, 而通过液态发酵技术来获取灵芝菌丝体则成为制备三萜的更有效的手段2。目前, 利用发酵法生产灵芝三萜类的文献报道有很多, 主要包括菌株筛选、发酵条件优化、分离纯化、结构解析、生物活性等方面。至今未见关于这些研究的系统性总结的报道。笔者在本研究单位在过去几十年对灵芝研究的基础上, 结合并总结国内外文献的研究报道报道, 对发酵生产灵芝三萜的研究现状加以归类和概括, 以期为后续的研究者提供借鉴和帮助。1 灵芝三萜的种类和结构至今为止从灵芝属中分离得到了 300 多种三萜类化合物。灵芝三萜类化合物是由异戊二烯单元组成的化合物3, 绝大部分属高度氧化的羊毛甾醇衍
12、生物, 包括三萜酸、三萜醇类等物质。按其碳原子数目可将其分为三大类, 分别为C24、C27、C30 型三萜4;按其所含功能基团和侧链不同有 15 种骨架, 并且其侧链长短不一, 从 2 个碳到 10 个碳不等。灵芝三萜类化合物的不同骨架结构如图 1 所示4。2 灵芝三萜的生物活性研究灵芝三萜具有多种生理活性, 主要具有保肝、抗高血压、抗 HIV-1 及 HIV-l 蛋白酶活性、抗氧化、抗肿瘤等重要作用5-7。Li 等8对已受肝损伤的小鼠分别注射 10 mg/kg 和 30 mg/kg 的灵芝酸, 7 天后发现乙型肝炎病毒 (HBV) 的抑制率比对照分别提高了 20%和 44%。Weng 等9研
13、究表明富含灵芝酸的灵芝提取物可作为高侵袭性肝癌细胞肿瘤发生和转移的化学预防剂。刘冬等10研究表明灵芝三萜类物质对原发性高血压大鼠有显著的降压作用。郭芳等11测定了不同剂量的灵芝发酵液对大鼠脑组织总抗氧化活力的影响, 发现灵芝发酵液1.2 g/kg 可明显提高总抗氧化活力。在过去几十年中, 许多癌症患者通过使用天然产物作为替代或补充性药物, 以减少或预防癌症治疗期间或治疗之后带来的副作用, 从而改善其生活质量。三萜类化合物是灵芝的主要活性成分之一, 对其抗肿瘤作用已有广泛研究。其中, Su 等12测定了 15 个灵芝酸三萜化合物对囊肿发育的影响, 结果发现灵芝酸乙酯 C2 在体外对囊肿的增长具有
14、有效的抑制作用。Liu 等13发现灵芝酸 DM对 PC-3 细胞显示出明显的细胞毒作用。Shao 等14研究发现灵芝酸 F, 灵芝酸K, 灵芝酸 B, 灵芝酸 D 和灵芝酸 AM1 在对 He La 人宫颈癌细胞有抑制作用。3 灵芝三萜的检测目前, 灵芝三萜最常用的测定方法主要集中在化学法和 HPLC 法, 其中化学法主要是以齐墩果酸或熊果酸为对照品, 以 5%香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂, 通过比色法来测定灵芝中总三萜的含量。但是由于标准品齐墩果酸与灵芝中三萜成分结构存在差异, 并且灵芝中含有较多的干扰物质, 导致化学法的测定结果存在比较大的误差。而相比于化学法, HPLC 是一个比较
15、精确的含量测定方法, 它可以减少干扰物质对三萜含量的影响15, 但是需要对照的标准品。另外由于灵芝中三萜化合物种类丰富, 且具有相似的结构特征, 也导致开发准确定量灵芝三萜的 HPLC 色谱也存在许多困难, , 导致了灵芝三萜质量标准难以提高。近年来, 针对 HPLC 方法的困难, 不同研究者开展了灵芝三萜高效液相测定方法的研究, 大部分的研究主要针对灵芝子实体的三萜成分, 而对菌丝体三萜成分的研究开展的比较少。贾红岩等16建立了同时测定灵芝子实体中 12 种三萜成分的高效液相色谱法。Wu 等17通过 HPLC-PAD 和 HPLC-MS 分析了中国15 个不同省份的 15 个样品。通过 HP
16、LC 检测到 47 种化合物, 并对其中 42 个化合物做出了初步鉴定。丁平等18建立了可同时测定 6 种三萜酸的含量 RP-HPLC 方法。总体来说, 使用 HPLC 对灵芝三萜成分含量检测已有广泛研究, 但分离效果并不够理想, 或者建立的方法所测成分较少, 同时, 适用子实体分离的方法并不一定适用菌丝体, 因此需要进一步研究。4 灵芝三萜液态深层发酵国内研究进展4.1 灵芝三萜生物合成途径研究三萜类化合物是灵芝合成的一种具有广泛的生理作用的化合物。目前, 对于灵芝三萜的提取分离以及药理作用已有广泛的研究, 而对灵芝三萜类化合物的合成代谢途径研究的较少, 并且不够深入。因此, 近年来对于灵芝
17、三萜合成过程中的相关酶与相关基因也已成为研究热点。灵芝三萜化合物的合成途径现在解析如下图 219。图 1 灵芝三萜的基本骨架结构 下载原图Chen 等16研究发现, 与其他萜类化合物的合成类似, 灵芝三萜是由甲羟戊酸生物合成途径合成的。并通过 IPP 的逐渐累积, 形成 GPP, FPP 等更高分子的异戊二烯类化合物。Lichtenthaler 等20发现在此合成过程中 IPP 为异戊二烯生物合成的一个重要前体。在此合成过程中, 多种酶也参与代谢, 其中 SQS 和LSS 是灵芝三萜合成的关键酶, 同样地, FPPS 是影响灵芝三萜前体法 FPP 含量的关键酶21。在基因表达分析结果中可以得出
18、, HMGR 与灵芝重要三萜的生物合成呈正相关22, FPPS 基因可在菌丝生长阶段表达, 并且在形成原基后表达量显著提高23。对灵芝的全基因组进行测序得出, 编码细胞色素 P450 的基因中有 78 个 CYP 基因与灵芝三萜重要前体羊毛甾醇的合成酶 (LSS) 共表达, 这提示研究者 CYP 可能与灵芝三萜的合成有关19。4.2 灵芝三萜液态深层发酵调控目前, 利用代谢调控手段提高液态深层发酵灵芝三萜的得率是现在研究的一个热点。在发酵过程中, 通过选择合适的培养基, 调节发酵过程的营养因子和环境因子参数, 或者在发酵体系中加入外源物质等手段都可以用来影响三萜的合成代谢, 达到提高灵芝三萜的
19、得率的目的。4.2.1 灵芝发酵培养基(1) 碳源灵芝液体深层发酵常用的碳源主要有葡萄糖、果糖、淀粉、玉米粉、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、酒糟等。使用复合碳源对提高发酵灵芝多糖和灵芝酸的产量有利24。Tang 等25研究发现乳糖对菌体生长、灵芝酸和胞内多糖的和产生有益。鲍锐等26筛选出灵芝发酵产三萜的最佳碳源为玉米粉。王谦等27研究表明, 灵芝深层培养的适宜碳源为玉米粉和葡萄糖。Wei 等28在灵芝发酵培养中采取蔗糖分批补料方式, 在 10 L 发酵罐残糖添加量低于 15 g/L 时添加蔗糖, 可使菌丝体生物量、灵芝三萜产量分别提高 62%、40%。图 2 灵芝酸的生物合成途径 下载原图(2)
20、氮源氮作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他含氮化合物的重要成分, 是影响细胞生长及代谢的重要因素29。因此选择合适的氮源种类并确定其最佳用量对促进灵芝三萜的合成也至关重要。一般用到的氮源有酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、麸皮、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、谷氨酸等, 已有研究发现灵芝对有机氮源的利用优于无机氮源30。潘继红等31对灵芝液体培养营养需求作了探讨, 筛选后得出黄豆饼粉为灵芝发酵最适氮源。Liu 等32通过液体摇瓶发酵优化了灵芝菌株的培养基组成和发酵条件, 得出最优氮源也为氮源为黄豆饼粉, 这与潘继红研究一致。冯杰等33从硫酸铵、氯化铵、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉五种氮源中筛选出酵母粉为沪农一号发
21、酵的最优氮源30。(3) 无机盐灵芝在液体发酵过程中添加少量的无机盐有利于目标产物的产生, 通常 Mg、K和 P 是灵芝菌丝体正常生长的必要条件。其中, 磷主要参与糖代谢, 镁离子存在于细胞膜和细胞壁, 与碳源的氧化有关。两者的用量与菌体生长有着直接的关系34。叶盛权等35在研究了 K、Mg 和 Fe 对灵芝多糖含量的影响之后发现添加了 Fe 的发酵培养基菌丝体的生物量和多糖产量最多, 分别为 7.299 g/L和 0.720 g/L。Xu Y N 等36在灵芝液态培养开始时加入 10 mmol/L Mn 后发现总灵芝酸的产量提高了 2.2 倍。Li 等37使用 L-谷氨酰胺与 Cu Cl 综
22、合控制策略, 得出灵芝三萜的含量为 1.87 mg/100 mg, 比单独使用 L-谷氨酰胺和 Cu Cl提高了 4.2、2.1 倍。(4) 维生素据报道, 在灵芝发酵培养中添加维生素类物质可促进菌丝体的生长, 其中 VB1的使用最为广泛, 因此诸多研究者选择添加 VB1 作为灵芝发酵培养基的一种生长因子来促进菌丝体的生物量和活性物质的含量, 如 Tang 等38在发酵培养基中加入了 0.05 g/L 的 VB1, 朱会霞等39在种子培养基和发酵培养基中分别添加了 1%和 0.005%的 VB1。并且, VB1 的添加量对灵芝发酵有一定的影响, 陈志玲等40探究了不同浓度的 VB1 对灵芝液体
23、发酵的影响, 下发现当 VB1 添加量为 1.0%时, 菌丝体内三萜含量达到最大, 为 23.56 mg/g。4.2.2 发酵条件(1) 温度灵芝液态发酵的温度范围在 2235, 较高或较低温度都不利于菌丝体生长。低温时, 菌丝体生长缓慢, 高温时菌丝容易老化, 随着时间延长菌体逐渐自溶, 并且发酵液颜色加深。不同温度可影响灵芝中活性成分的产量1。李平作等41在 25 L 发酵罐上对灵芝发酵产三萜酸的工艺优化, 得出在温度为 30时, 灵芝酸的最高产量是 0.36 g/L 发酵液。汪金萍等42研究 5 个不同的温度梯度, 得出 28时更适合灵芝菌丝生长。现阶段, 采取变温策略控制灵芝三萜液体发
24、酵已成为一种重要手段, 本实验室研究者 Feng 等43建立了一种温度变换控制策略, 分 3 个阶段改变发酵温度, 分别实现了三萜合成水平、产量和生产率的升高, 分别为 27.32%, 13.94%和 37.11%36。(2) 培养基 p Hp H 值可影响代谢途径中各种酶的活性, 是影响真菌菌丝体生长及产物分泌的重要因素。研究 p H 值在灵芝发酵过程中的变化规律, 并通过一定方法控制发酵过程中 p H 值的变化, 对提高灵芝发酵的灵芝酸的产量具有重要意义。Ling39的研究发现菌丝体生长及胞内灵芝酸生成的最适 p H 5.5, 胞外灵芝酸产生最适 p H 4.5。刘冬等44认为菌丝体生长及
25、胞内多糖产生的最适 p H 5.4, 胞外多糖产生的最适 p H 4.6。Wang 等45使用响应面方法优化发酵的关键条件, 得出菌丝体三萜酸的最佳发酵 Ph 6.0。近年来也有研究者采用分阶段调节 p H 值对灵芝进行发酵培养的工作报道, Tang 等46在发酵前 4 天控制 p H 3.0, 紧接着设置为 p H 4.5 继续培养 6 天。得到灵芝酸的产量为 321.6 mg/L, 这比单独在 p H 3.0 和 p H 4.5 条件下分别提高了 50%和 300%。(3) 转速在发酵过程中搅拌剪切力对灵芝的生长有显著影响, 实验室摇床培养过程中直接控制搅拌剪切力的途径即为调节转速, 赵娜
26、等47在 5.5 L 发酵罐中发酵灵芝, 采用了变转速调控策略, 对振荡发酵阶段进行优化, 以期达到高产三萜的目的。振荡阶段最佳条件为转速由 150 r/min 变为 100 r/min, 该策略与液体静置培养相结合, 最终菌丝体三萜产量高达 678.0 g/L, 比优化前提高了21%。Feng 等48开发了一种简单且可重现的两阶段转速控制来实现三萜增长的策略, 即在第 40 h, 将搅拌速度控制在 150 r/min, 随后将搅拌速度控制在100 r/min, 使三萜的最大浓度达到 0.086 g/L, 产量为 6.072 g/kg, 生产率为6.53210g/h, 相比对照组分别提高了 3
27、9.61%, 36.48%和 49.22%。(4) 通气量灵芝菌丝体的代谢过程需要消耗氧气。发酵中合适的通气量是确保溶解氧浓度的直接手段, 不仅可使细胞在生长时有充足的氧气, 而且会影响菌丝体代谢过程中各种关键酶的活性。因此在灵芝液态发酵过程中必须保证稳定而合适的溶氧环境, 即稳定合适的通气量49。在发酵初期, 菌丝量较少, 可使用较低的通气量。随着菌丝生长不断加快, 通气量需加, 发酵后期, 菌丝衰老, 代谢能力减弱, 通气可适当降低1。孙金旭等50使用正交实验在 10 L 发酵罐上寻找最优发酵工艺, 发现通气量为 0.4 L/ (Lmin) 时, 菌丝体干重和胞内三萜达到最大, 分别为 8.27 g/L 和 171.27 mg/L。同时, 本实验室研究者在 5 L 发酵罐中对灵芝三萜的扩大培养条件进行优化, 得出通气量为 8 L/min 时, 三萜合成得率和生产强度最大49。(5) 外源添加物
