1、 暨南大学硕士学位论文题名：基于碳纳米管的杂色曲菌素电化学传感器电极的构建和性能研究Fabrication and Study of Performance of VersicolorinA ElectrochemicalSensor Electrode Based on CNTs作者姓名： 张红英指导教师姓名：刘大岭及学位、职称：教授姚冬生教授学科、专业名称：生物化学与分子生物学论文提交日期：2014年 5月论文答辩日期：2014年 6月 6日答辩委员会主席： 苏晓鸥研究员论文评阅人：邹小勇教授 鲁志松教授学位授予单位和日期：暨南大学 2014年 6月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人
2、在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学 有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保
3、密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： 导师签名：签字日期：签字日期： 年 月 日 年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位： 电话：邮编：通讯地址：暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究摘要目的：黄曲霉毒素是一类具有强致癌性、致畸性和遗传毒性的真菌毒素。是污染粮食和饲料的主要毒素之一，对人和家禽家畜的危害极大。其中黄曲霉毒素 B1（AFB1）毒性最大，污染也最为普遍。杂色曲菌素（Ver A）是 AFB1生物合成途径中重要的前体物，与AFB1的生物合成密切相关。前期研究表明 Ver A能够作为监测仓储粮食黄曲霉毒素污染的预报性的生物指示物。建
4、立快速灵敏简单的 Ver A检测方法具有重要意义。电化学传感器具有成本低廉，操作简便，检测快速，灵敏度高，不用繁琐的样品前处理，可以实时监控以及易微型化等优点。本文拟建立检测 Ver A的电化学传感器方法。方法：通过培养寄生曲霉突变株来产生 Ver A，得到 Ver A 标准品，并通过质谱对其进行鉴定后作为检测底物。修饰电极的构建通过自组装技术将半胱胺（CSm）和单壁碳纳米管（SWCNTs）组装到金电极上。优化了修饰电极的构建方式，用原子力 显微镜、扫描电镜、循环伏安法和交流阻抗法对其进行了表征,并对构建的传感器进行了性能评价。结果：（1）分离纯化得到 Ver A标准品 3.0mg。（2）确定
5、了检测 Ver A 的电化学传感器的构建方式为 SWCNTs/CSm/Au 。（3）获得的传感器对 Ver A 的检测表现出较好的性能：检测线性范围为 1001200ppb，检测限为 75ppb（3SD/slope），灵敏度为 0.30A.ng-1.ml.cm-2，以及常见的电活性物质对其不产生干扰。组装的电化学传感器具有较好的重现性和稳定性，相同条件下重复检测 400ppb的 Ver A 12次，响应电流的 RSD为 4.6%；同批制作 7根修饰电极检测350ppb的Ver A，RSD为4.2%；放置 30天后，其响应电流为初始值的98.2%。当用于加标玉米样品检测时，加标回收率在 95.5
6、%111.8%之间，RSD在 1.1%6.2%之间。结论：建立了杂色曲菌素传感器电极的组装方法，杂色曲菌素的传感器检测法具有响应迅速、设备简单、无需复杂的样品预处理的特点。关键词：电化学传感器；单壁碳纳米管；杂色曲菌素；快速检测I暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究AbstractObjective: Aflatoxins (AFs) are one group of the most potentially carcinogenic, teratogenicand genotoxic substances. AFs are found to be o
7、ne of the predominant mycotoxins incontaminating food and feed. They are seriously harmful to humans, livestock and poultries.Among them afltoxin B1 is the most toxic and commonly contaminant. VersicolorinA (Ver A) isan important precursor of AFB1 biosynthetic pathway. And it is closely related to t
8、hebiosynthesis of AFB1. Previous investigation indicated that Ver A is a feasible predictivebioindicator for aflatoxins-contamination of storage-crops. Therefore, to establish a rapid,sensitive and easy method for Ver A detection is important. Electrochemical sensors have theadvantages of such as lo
9、w cost, simple operation, rapid response, high sensitivity, withouttedious sample pre-treatment. The sensors are potentially developed to be real-time monitoring,miniaturize and portable. Thus, in this thesis, an electrochemical sensor for Ver A wasconstructed. And a sensor way of Ver A detection wa
10、s set-up.Methods: Ver A standard was prepared from a mutant of Aspergillus parasiticus andidentified by mass spectrometry. The sensor was constructed by self-assembly technique.Cysteamine (CSm) and single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) were assembled onto thegold electrode with step-by-step optimi
11、zation. The surface of the constructed sensor was viewedwith atomic force microscopy. The processes of caroxylation SWCNTs and sensorsconstructions were monitored by infrared spectroscopy, cyclic voltammetry and electrochemicalimpedance spectroscopy.Results: (1) Three-milligram of Ver A standard was
12、 obtained. (2)The optimized way to buildthe Ver A sensor was found to be SWCNTs/CSm/Au. (3)The final obtained Ver A sensor showedacceptable performances including of a wide linear range from 100ppb to 1200 ppb, a detectionlimit of 75ppb (3SD/slope), a sensitivity of 0.30A.ng-1.ml.cm-2 with a good se
13、lectivity to thegeneral electroactive interferences. The presented Ver A electrochemical sensor had theadvantage of a good repeatability. Under same conditions, the RSD of 12 replicatedeterminations of 400ppb Ver A was 4.6%. Seven one-patch-made electrodes showed a 4.2% ofRSD of 350ppb Ver A detecti
14、on. The Ver A-sensor was stable, it remained 98.2% of theII暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究original current value after a 30-day of storage at 4. After a simple preparation of 80%methanol extraction, the sensor-way of Ver A detection for standard samples (6 corn-powders)had giving acceptable
15、recovery values from 95.5% to 111.8% with RSD in the range of1.1%6.2%.In conclusion: In this thesis, the assembling method of the Ver A sensor electrode wasestablished. The present sensor was easy to operate in Ver A detection, without the sophisticatedpreparation processes.Key word： electrochemical
16、 sensor; Single-walled carbon nanotubes; Versicolorin A;Fast-detectionIII暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究目录摘要IAbstract. II目录.IV英文缩略词.IX1 绪论11.11.21.3黄曲霉毒素简介1霉菌毒素的生物指示物1杂色曲菌素简介21.3.1 杂色曲菌素的理化性质2杂色曲菌素的毒性及其检测方法31.3.21.41.5生物传感器简介41.4.1 生物传感器概述4酶生物传感器41.4.2无酶电化学传感器51.5.1 无酶电化学传感器简介5无酶电化学传感器的优势6无酶
17、电化学传感器取得的研究成果7无酶电化学传感器的前景81.5.21.5.31.5.41.61.71.81.91.10碳纳米管8研究背景、目的及意义12研究的主要内容13本研究的创新性14技术路线152 Ver A标准品的制备.16实验设备与材料162.12.1.1 实验设备16IV暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究2.1.2 实验材料162.22.32.4实验方法182.2.1 寄生曲霉突变株的培养18Ver A的提取18制备型 TLC板初步分离 Ver A18半制备 HPLC 精制纯化 Ver A .19制备的 Ver A的 TLC分析 .19制备的
18、 Ver A的 MS鉴定.20Ver A的纯度分析202.2.22.2.32.2.42.2.52.2.62.2.7实验结果202.3.1 寄生曲霉突变株的培养20Ver A的提取21制备型 TLC板初步分离 Ver A22半制备 HPLC 精制纯化 Ver A .22制备的 Ver A的 TLC分析 .24制备的 Ver A的 MS鉴定.24Ver A的纯度分析252.3.22.3.32.3.42.3.52.3.62.3.7本章小结26Ver A电化学传感器电极构建方式的 优化2733.1 实验设备与材料273.1.1 实验设备27实验材料27主要的溶液283.1.23.1.33.2 实验方法
19、293.2.1 循环伏安法29交流阻抗法29微分脉冲伏安法30线性扫描伏安法：303.2.23.2.33.2.43.3 实验步骤30V暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究3.3.13.3.23.3.33.3.43.3.53.3.63.3.73.3.83.3.93.3.103.3.113.3.12金电极的打磨和清洗30碳纳米管的选择30单壁碳纳米管的纯化和羧化及红外光谱表征31单壁碳纳米管的透射电镜观察31羧化的 SWCNTs修饰电极.32SWCNTs滴涂在电极表面干燥温度的优化32组装 SWCNTs浓度的优化.33自组装单分子膜法（SAMs-SWCNT
20、s ）修饰电极的优化.33修饰电极的表面积34修饰电极各组装过程的特性表征35Ver A传感器电极的构建方式 36SWCNTs/CSm/Au组装过 程中不同电极对 Ver A的响 应性能 .363.4 实验结果373.4.1 金电极的打磨和清洗37碳纳米管的选择37单壁碳纳米管的纯化和羧化及红外光谱表征39单壁碳纳米管的透射电镜观察40羧化的 SWCNTs修饰电极.41SWCNTs滴涂在电极表面干燥温度的优化43组装 SWCNTs浓度的优化.45自组装单分子膜法（SAMs-SWCNTs ）修饰电极的优化.46修饰电极的表面积50修饰电极各组装过程的特性表征51Ver A传感器电极的构建方式 5
21、7SWCNTs/CSm/Au组装过 程中电极对 Ver A的响应 性能 .583.4.23.4.33.4.43.4.53.4.63.4.73.4.83.4.93.4.103.4.113.4.123.5SWCNTs/CSm/Au传感器 电极检测 Ver A条件优化及其性能 评价 .60实验设备与材料60本章小结5944.14.1.1 实验设备60VI暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究4.1.24.1.3实验材料60主要的溶液614.24.3实验方法614.2.1 循环伏安法61微分脉冲伏安法624.2.2实验步骤624.3.1 检测 Ver A条件的优
22、化.62SWCNTs/CSm/Au传感器 电极对 Ver A的响应性能 测定 .63SWCNTs/CSm/Au传感器 电极的抗干扰性 63SWCNTs/CSm/Au传感器 电极对 Ver A响应信号的重 现性 .63SWCNTs/CSm/Au传感器 电极的制作重现性 63SWCNTs/CSm/Au传感器 电极的存储稳定性 644.3.24.3.34.3.44.3.54.3.64.4 实验结果644.4.1 检测 Ver A条件的优化.64SWCNTs/CSm/Au传感器 电极对 Ver A的响应性能 测定 .67SWCNTs/CSm/Au传感器 电极的抗干扰性 68SWCNTs/CSm/Au传
23、感器 电极对 Ver A响应信号的重 现性 .69SWCNTs/CSm/Au传感器 电极的制作重现性 70SWCNTs/CSm/Au电极的存 储稳定性 704.4.24.4.34.4.44.4.54.4.64.5SWCNTs/CSm/Au电极检测 玉米样品中的 Ver A 72本章小结7155.15.25.3实验设备与材料725.1.1 实验设备72实验材料725.1.2实验方法735.2.1 回收率的测定73实际玉米样品中 Ver A的 检测.735.2.2实验结果745.3.1 回收率的测定74VII暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究5.3.2
24、实际玉米样品中 Ver A的 检测.755.4 本章小结756 总结讨论与展望76参考文献.78攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况.89致谢.90VIII暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究英文缩略词SWCNTsMWCNTsVer AAFsSingle-walled carbon nanotubes 单壁碳纳米管多壁碳纳米管杂色曲菌素Multi-walled carbon nanotubesVersicolorin AAflatoxin 黄曲霉毒素AFB1CSmCSAflatoxin B1 黄曲霉毒素 B1半胱胺CysteamineChitosan 壳
25、聚糖HRP Horseradish peroxidaseAtomic force microscopyScanning electron microscopeTransmission electron microscopeFourier transform infrared spectrometerCyclic voltammogramLine sweep voltammetryDifferent pulse voltammogramN-Hydroxysuccinimide辣根过氧化物酶原子力显微镜扫描电子显微镜透射电子显微镜傅里叶红外光谱仪循环伏安法AFMSEMTEMFT-IRCVLSV 线
26、性伏安扫描微分脉冲伏安法N-羟 基丁二 酰亚胺DPVNHSEDC N(3-dimethylaminopropyl)-N-ehyl-car 1-乙基 -3-(3-二甲基氨丙bodiimid hydrochlorid基)-碳二亚胺IX暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究1绪论1.1黄曲霉毒素简介黄曲霉毒素（AFs）是一种毒性极 强的霉菌毒素且具有高致畸性和高致突变性，其在谷物，花生，玉米，棉籽粕、豆粕等中普遍存在，在田间和仓储过程中均能生成黄曲霉毒素。由于其性质稳定，一般的加工方法很难将其去除或灭活。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1被国际癌症研究机
27、构（International Agency for Research on Cancer，IARC ）划定为I类致癌物， 对人和家禽家畜危害极大，各个国家都对黄曲霉毒素在食物中的含量进行了严格的限定，其中黄曲霉毒素 B1（AFB 1）毒性最 强，通常所说的黄曲霉毒素即指的是黄曲霉毒素 B 1，它的毒性是砒霜的 67倍1。近年来，黄曲霉毒素污染事件的频繁发生,已引起世界各国及消费者对食品安全的关注2，2013年 3月，荷兰乳业协会自去年从国内牛奶农场中发现超标黄曲霉毒素后，再次从该国两家牛奶农场中检出超标的这种致癌毒素。2013年，中国国家质检总局通报食品方面，一种炒货花生米黄曲霉毒素 B1超
28、标。2012年，5个批次的南山婴幼儿奶粉被检出强致癌物黄曲霉毒素 M1超标。北京食品安全办公布一款芝麻酱检出黄曲霉毒素 B1超标。2012年，长沙德胜斋食品厂生产的德胜斋牌蜂蜜茴饼（640g/袋）黄曲霉毒素 B1超标 18.4倍。2011年，一批次蒙牛纯牛奶和一批次长富纯牛奶(精品奶) 被检 出黄曲霉毒素超标。2011年，广东三个品牌的植物油黄曲霉毒素含量超标。目前检测黄曲霉毒素的方法已非常成熟，主要有1; 3; 4; 5：紫外线照射法1、ELISA法6 、碘-荧光法、微柱法1 、薄层色谱法7; 8（TLC）、免疫亲和柱荧光光度法、高效液相色谱法9（HPLC）、质谱法等。由于黄曲霉毒素的毒性，
29、建立预警式的检测和监测手段是粮食和食品安全管理（HACCP）的必要手段。1.2霉菌毒素的生物指示物霉菌的指示物，是指食品被污染后产生的效应物，此效应物可能与毒性无关，但其量可以反应食品被污染的程度。挥发性化合物（volatile compound）、麦角甾醇（ergosterol）、几丁质（chitin）等10 是已报道的食品中真菌污染的指示物。可通过感应器对挥发性化合物进行检测来确定真菌的生长情况；麦角甾醇可以作为活真菌生物量的生物指示剂11; 12，因为麦角甾醇为真菌所特有，若其含量超过 8mg/kg，则表示可能受到真菌污染10 。麦角甾醇1暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无
30、酶电化学传感器的构建和性能研究还与一些真菌毒素的生成有关，可能成为一些真菌毒素的指示物；几丁质通常只在昆虫、甲壳类动物及真菌中产生。在人体内 AF-白蛋白加合物是一种 AF暴露的长期生物标志物，其半衰期为 14-20天，与正常健康人白蛋白的半衰期相似，表明 AF-白蛋白加合物是稳定的，可以用作 AFB1暴露超过周或月的靶向生物标志物13。所以测定血清中 AF-白蛋白加合物，能较确切地反映人体暴露于 AFB1的水平14。另外 AF可与鸟嘌呤结合生成 AF-N7-鸟嘌呤加合物，该加合物与肝癌具有显著相关性，并且其在尿液中的量化是 AFB1暴露的很好的生物标志物15 。上述指示物能够监测出人群是否有
31、暴露黄曲霉毒素以及程度如何。但对于粮食储藏和运输环节尚需要建立能够预警性的、先行性地监测黄曲霉毒素产生的检测手段。谭挥勇、方明英的研究表明，利用 Ver A是 AFB1生物合成的前体物，以 Ver A 为指示物预警黄曲霉毒素的污染是可行的16 。1.3杂色曲菌素简介1.3.1 杂色曲菌素的理化性质在 AFB1的生物合成过程中，涉及多种前体物质，其中一种为杂色曲菌素（VersicolorinA）。AFB 1生物合成 过程 17; 18; 19; 20见图 1。杂色曲菌素（Versicolorin A，简称 Ver A或者 VA）又称 1,6,8-三羟基-2-羟甲基蒽醌，是 AF生物合成途径中的重
32、要前体物质。1975年，Lee等人21从 Aspergillus parasiticus的突变株（Aspergillus versicolor）中首次分离得到 Ver A ，其分子式为 C18H10O 7，分子量为338，熔点为 287-288。其 结晶为橙黄色针状晶体，它能溶于甲醇、乙醇、丙 酮、已烷、氯仿、乙醚、醋酸乙酯，能溶于氢氧化钠及碳酸钠溶液并呈红紫色，在浓硫酸中呈紫色，稀释之后变为橘黄色。其乙醇溶液遇醋酸镁呈橙红色。它微溶于苯，不溶于石油醚，不溶于水和碳酸氢钠溶液。其红外光谱 IR（cm-1）为:1625 ，1679，3340；质谱 MS （negative ESI-MS）为：m/
33、z 337；m/z 337的 MS/MS为 309，308，293。其紫外最大吸收值（以乙醇为溶剂）为 222，254，265，290，321，45321，其中 290nm（甲醇 288nm ）为 Ver A 的紫外特征吸收波长22 。2暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究图 1黄曲霉毒素的生物合成途径17; 18; 19; 20Fig. 1 The biosynthetic pathway of the aflatoxin17; 18; 19; 20.1.3.2 杂色曲菌素的毒性及其检测方法早在1980年，Wong 等人23; 24; 25 就对杂色
34、曲菌素的致畸性和急性毒性做了初步的研究，得到其致突变剂量（Ames test）为 800ng/皿，LD50（小鼠静脉注射）为 20 mg/kg。尽管如此，杂色曲菌素的毒性并没有引起相关部门的关注和重视，对杂色曲菌素在饲料和粮食中的污染也没有制定相关规定。杂色曲菌素的分析检测方法主要以薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）为主。关于 Ver A的 TLC检测方法如：chang等人22利用展开剂甲苯/ 乙酸乙酯/冰醋酸=50/30/4分离检测 Ver A取得了较满 意的效果，相应的迁移率为 0.87。常见的其他展开剂系统还有苯酚/冰醋酸=95/526；氯仿/丙酮=95/5 26；甲苯/丙
35、酮=2/1 27等等。关于 Ver A 的 HPLC 检测方法如： Billington 等人 28以甲醇/乙腈/0.053N乙酸=42.5/42.5/15作流动相，以流速1.5ml/min，检测波长 288nm下分离检测 Ver A，其 RT为 3.26min；Mccormick 等人29 选择流动相为醋酸铵水溶液和甲醇，成功地分离检测出 Ver A，其 RT 为 29.01min。谭辉勇等人30以水和甲醇为流动相，以流速 4ml/min，检测波长 288nm ，采用半制备 HPLC制备得到3暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究Ver A样品，再以
36、10mmol/L醋酸铵-20mol/L乙酸钠溶液(A)和 10mmol/L醋酸铵-20mol/L乙酸钠甲醇溶液(B)为流动相，采用梯度洗脱，以流速 0.3ml/min ，采用二极管阵列检测器，检测波长 288nm，对制备得到的 Ver A样品进行纯度分析，结果表明无其他杂质峰出现，目的峰纯度达到 99.99%，且用质谱鉴定进一步确定其为 Ver A 。1.4生物传感器简介1.4.1 生物传感器概述生物传感器是利用生物活性物质与换能器相结合的一种生物物质敏感器件。它是以生物活性物质为主要的功能性元件（感受器），来感受特定的目标物而产生特定的生物化学信号，并按照一定规律将产生的感知信号转换成可识别
37、信号的装置或器件。大多数的生物活性物质如核酸31; 32; 33; 34; 35、酶36; 37; 38; 39、抗原抗体 40等都可作为分子识别元件；信号转换部分（换能器）主要有电化学电极41; 42; 43、光学检测元件44; 45; 46、热敏电阻、场效应晶体管47; 48 、压电 石英晶体49和表面等离子共振50; 51; 52等53 。一旦靶分子与分子识别元件专一性结合，换能器立即将产生的反应结果 (产生的热、光、声、电等或形成的复合物 )转变成与靶分子浓度相关的光或电信号输出，通过电子系统处理和显示，进而达到分析检测的目的。其工作原理如图 2所示。图 2 生物传感器的工作原理图Fi
38、g. 2 The working principle of biosensors.1.4.2 酶生物传感器生物传感器根据分子识别元件的不同，可分为酶传感器、微生物传感器、细胞传感器、组织传感器和免疫传感器等；按照换能器的不同分为电位型、电流型、电导型和电容型等4暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究生物传感器。1962年 Clark等人54 提出把酶与电极结合来测定酶底物的设想。1967年 Updike和Hicks55 研制出世界上第一支葡萄糖氧化酶电极，用于定量检测血清中葡萄糖含量。此后，酶生物传感器引起了各领域科学家的高度重视和广泛研究，得到了迅速发
39、展。酶生物传感器是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器。酶生物传感器具有操作简便、灵敏、快速、价廉、可重复连续使用等特点，且与传统分析方法相比，酶生物传感器是由固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：（1）由于酶的专属反应性，使其具有高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定；（2）它既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度。因此，酶生物传感器在生物传感器领域中占有非常重要的地位。酶生物传感器在生物医学、食品分
40、析、环境监测等领域有重要应用。酶生物传感器在食品检验中的应用相当广，几乎渗透到了各个方面，包括食品添加剂分析、食品中成分分析、鲜度的检测、感官指标、食品工业生产在线监侧及一些特殊指标（如食品保质期）的分析。不过酶生物传感器的研制过程有诸多难点：（1）酶生物传感器是基于生物活性物质酶构建的，但酶的电活性中心一般深埋在其分子内部，导致活性中心与电极间的直接电子传递比较困难；（2）将酶固定到电极表面时必须有可以将酶固定到电极表面上的生物相容性材料，且此材料不会使酶的性质发生改变；（3）酶的价格昂贵，并且酶活性会随着时间的增加而降低，其活性受 pH和温度的影响较大，在催化氧化 过程中也容易受溶液中溶解
41、氧的干扰等；（4）酶固定到电极表面的数量有限。这些问题导致酶生物传感器的稳定性、灵敏度和重现性下降，导致在一定程度上限制了其实际应用，因此探究新的方法或构建新型的无酶传感器将有助于这些问题的解决。1.5无酶电化学传感器1.5.1 无酶电化学传感器简介无酶电化学传感器是指识别元件由非生物物质组成，如金属纳米材料，石墨烯，碳纳5暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究米管，聚合物等，并采用电化学方法来检测目标物。电化学分析方法一般通过电化学传感器实现，具有灵敏度高、响应快、仪器设备便宜、操作简单、选择性好等优点。1.5.2 无酶电化学传感器的优势对于无酶电化学
42、传感器，修饰在电极表面的材料可以直接实现底物与电极间的电子交换，并且电极上没有生物活性物质，将有助于提高电极检测的稳定性、重现性、灵敏度及检测限。此传感器和酶传感器相比：可长期使用且制作简便。所以，发展新型的无酶电化学传感器具有重要意义，也是一种新的发展趋势。无酶电化学传感器具有众多优势，例如：（1）由于无酶电化学传感器的识别元件为非生物物质，所以无酶电化学传感器能有效避免外界环境因素带来的巨大影响，避免生物物质活性下降而带来的信号减弱问题。（2）无酶电化学传感器有利于实现多组分生物分子的同时检测。在生物诊断，药理分析，食品安全等领域实现多组分生物分子的同时检测具有重要意义56; 57; 58
43、; 59。虽然生物传感器在生物分子同时检测的方向上引起研究者的兴趣，但由于抗原或酶等都具有特异结合性，因此同时检测多组分就需要多种蛋白质或酶。但无酶电化学传感器则可以避免这个问题。无酶电化学传感器可以利用不同组分在同一敏感材料界面的电化学氧化还原电位的不同，进行电位-电流扫描，则在不同电位下会出现峰。所以现有的工作大多采用无酶电化学传感器来进行多组分的检测。但由于材料的催化能力并不针对所有物质，以及某些物质的峰电位可能相近，因而在研究同时检测的工作中，首先要注意敏感材料的选择：既能分离各目标物的峰电位使彼此不干扰，又能达到对目标物的催化作用。在临床医学中，尿酸（UA）是嘌呤代谢的终产物，肾上腺
44、素（NE）引起动物或人体兴奋激动，而抗坏血酸（AA）作为新陈代谢的必需物质，对 UA、NE和 AA的同时检测可用于诊断人体的健康状况。因此，快速灵敏的同时检测方法很重要，除了常规的色谱检测法，无酶电化学传感器的出现引起了研究者的关注。Wang 等人60制备了聚酪氨酸 /羧化多壁碳纳米管复合物修饰电极，用于同时测定 AA、DA和 UA，得到 AA和 DA、DA和 UA循环伏安的氧化电位差分别为160mV、150mV，其测定 AA、DA和 UA的检测限分别为 2.0、0.02和 0.3mol/L，此方法具有好的选择性和高的灵敏度，成功地用于人血清中 AA、DA和 UA的同时测定，总之是依靠将这些物
45、质的氧化电位进行分离，从而达到同时检测的目的61; 62。（3）无酶电化学传感器在生物活性物质中的应用比较受关注。生物活性物质在体液6暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究中，且在人体内的含量相当低，在体外较易被氧化还原，使得检测有所偏差，所以检测需要进行复杂的前处理过程，需要具备高灵敏度的检测方法，需要能进行在线检测的技术。这三个问题限制了其检测的发展，直到具备灵敏度高、检测限低、仪器简单廉价、操作简单等优点的生物传感器的出现。但其在线检测问题还是没有得到解决，不过无酶传感器有助于解决这个问题，特别是近年来，出现了纳米尺度的电极，与普通电极相比，其具有
46、众多的优势，其中最重要的是纳米电极提高了空间分辨率，也即可以准确地测定某个位置（如某个单细胞或某组织的表面等）的物质浓度。这个优势使得纳米电极可以直接进入活体生物内，而造成极小甚至没有组织伤害。Zhang63 等人将 PANI/Au 纳米复合物修饰在纳米电极表面，构建出检测多巴胺的纳米传感器，此修饰的纳米传感器对磷酸缓冲液中的抗坏血酸和多巴胺的氧化表现出很好的电催化活性，且抗坏血酸和多巴胺的氧化电位相差250mV，采用微分脉冲伏安法可以选择性地从含有抗坏血酸的溶液中检测多巴胺，检测线性范围为 0.3200mol/L ，检测限为 0.1mol/L ， 这种纳米无酶传感器可以直接插入人体组织，有望
47、用于体内多巴胺的直接检测。1.5.3 无酶电化学传感器取得的研究成果由于无酶电化学传感器避免了酶传感器的一些缺点，且因其灵敏度高、检测限低、制备简便、操作容易、稳定性强和重现性好等诸多优点，引起了人们的广泛研宄。最近几年，研宄者已将许多不同类型的纳米材料用于构建无酶传感器，并取得了一定的研究成果。Zhong等人64 将 MWCNTs、聚苯胺和 Pt纳米颗粒一起电沉积在玻碳电极表面，并用扫描电镜和循环伏安法对其进行了表征，然后用于过氧化氢的检测，检测线性范围宽（7.0mol/L2.5mmol/L），检测限低（2.0mol/L），灵敏度高（748.4 AmM1cm2），响应时间短，稳定性好，且不被
48、常见物质干扰，已经成功应用于消毒水中过氧化氢的检测。Jiang等人65制得 纳米铜修 饰的氮掺杂石墨烯（Cu-N-G），作为新型传感材料用于构建灵敏的无酶葡萄糖传感器，相比单纯的纳米铜（CuNPs），Cu-N-G对葡萄糖的氧化显示出更高的电催化活性，葡萄糖的氧化峰电流大约高出 23倍，此传感器对葡萄糖的检测表现出极好的性能，包括宽的线性范围（0.0044.5mmol/L ），低的检测限（1.3mol/L, S/N=3），高的灵敏度（48.13 AmM-1），短的响应时间（5s），对常见的共存干扰物具有好的选择性。Ping等人 66用离子液体和单壁碳纳米管 (IL-SWCNTs)修饰电极用于测定
49、抗坏血酸7暨南大学硕士学位论文 基于碳纳米管的杂色曲菌素无酶电化学传感器的构建和性能研究（AA），此电极综合了 IL和 SWCNTs的优点，相比用石墨或石蜡油构建的复合电极，IL-SWCNTs复合 电极对电活性物质的电子传递速率明显增加了，对 AA氧化的过电势显著减小了（AA在该电极上的氧化电位为 0.005 V，远低于玻碳电极上的+0.325 V），检测线性范围宽（3mol/L4.2mmol/L），检测限低（1.0mol/L），并应用于食品样品中 AA检测。Li等人67用十二 烷基硫酸钠（SDS ）修饰单壁碳纳 米管(SWCNTs)，得到 f-SWCNTs修饰玻碳电极，相比裸 GCE，f-SWCNTs/GCE表现出非常好的电化学催化活性，可使 DA和 UA氧化的过电势显著减小，氧化峰电流显著增大，同时 AA的氧化峰电流相应减小，
