1、冠脉旁路术中转染抗 NF-B 核酶基因防治犬移植静脉桥再狭窄的研究中华医学杂志 2006 年 8 月 8 日第 86 卷第 29 期NailMedJChina,August8,2006,V0l86,No.29冠脉旁路术中转染抗 NFKB 核酶基因防治犬移植静脉桥再狭窄的研究刘子雄赵强陈安清徐德民孙晓宁蔡俊峰大隐静脉是冠脉旁路手术中重要的移植血管桥,然而其远期通畅率却较动脉桥低,10 年通畅率仅有 60%左右,其中又有 50%的患者伴有不同程度的移植血管再狭窄,因此限制了其应用.而动脉桥来源有限且取材不便,也影响了冠脉搭桥手术的发展.我们以 pUC.SRct 为载体,阳离子脂质体介导的针对 NF
2、.kBmRNA 的核酶 R65 转染冠脉旁路术模型犬静脉移植血管,观察其抑制内膜形成及中膜平滑肌增生的作用.一,材料与方法1.实验试剂:阳离子脂质体转染试剂 DOTAP购自德国 BoehringerMannheim 公司;PCNA 单克隆抗体,sP 试剂盒购自北京中山公司;质粒 p4395 由美国韦恩州大学高山博士惠赠;pUC-SRct 购自美国Clontech 公司 ;质粒小量制备 ,大量制备试剂盒及各种限制性内切酶购自美国 Promega 公司;TrizolRNA提取试剂盒购自美国 GIBCO 公司;PCR 产物纯化,凝胶回收试剂盒购自德国 QIAGEN 公司.2.实验动物与仪器:健康雄性
3、杂种犬 12 只(复旦大学实验动物中心提供),体重 1820kg,PCR仪为美国 PE 公司产品,CMIAS 图像处理与分析系统,SERVO900 型呼吸机,Spacelabs511 心电监护仪,GD350.B 大功率高频电刀(上海沪通电子仪器厂),TuRRAx5basic 型匀浆器,常用手术器械和显微外科血管吻合器械.3.核酶设计和质粒构建:以 Symons 提出的锤头状核酶结构模型为基础 j,针对 NF.KBp65mRNA(GenBank 登录号:396027),计算机模拟设计核酶 DNA 片段 J,并且对底物切点两翼基因片段做同源系列分析,在核酶 DNA 片段两端设计 BamHI和 Ac
4、cI 酶切位点 ,将核酶 DNA 片段克隆到载体p4395,将克隆有核酶的质粒 p4395 及 pUC-SRct 分别用 EcoRI 和 NotI 双酶切 ,回收核酶 280bp 片段和 pUC.SRct4.9kb 片段后连接,亚克隆至 pUC-SRct作者单位:200032 上海,复旦大学医学院附属中山医院心外科.新技术新方法.后转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞 ,筛选阳性克隆后质粒小量制备,经过 I,NotI 酶切鉴定后,质粒大量制备.4.质粒脂质体复合物制备:将阳离子脂质体转染试剂 DOTAP 与胆甾醇以 1:1 摩尔比配制后经高频声波处理 20min,得到转染试剂.将核酶质粒悬于 6
5、00Ixl5%葡萄糖水 ,与转染试剂等体积混合 ,吹打混匀后置于室温下平衡 20min,呈现雾状浑浊,但无沉淀或凝块出现,在 4下保存待用.5.冠脉旁路动物模型建立和脂质体转染:根据随机数字表将 12 只犬随机分为核酶转染组和空质粒对照组.实验犬肌注氯氨酮(5mg/kg)后气管插管,并以 1.5%七氟醚吸入维持全身麻醉,在左后肢做长切口,以无接触技术取约 10cm 大隐静脉,4 号丝线结扎分支,肝素盐水灌洗后,用加压灌注法将约40l 核质粒脂质体复合物或空载体注入血管段,室温下保持 20min;左侧第 4 肋间切口,以 Octopus 固定器固定心脏局部,用 7-0Prolene 线将大隐静脉
6、吻合于冠状动脉左前降支,大隐静脉另一端与降主动脉以 6-0Prolene 线行端侧吻合 ,冠状动脉左前降支近端以 4_()Prolene 线结扎 ,完成不停跳冠脉搭桥.术后饮食中加入肠溶阿司匹林(每天 50mg)抗凝治疗,继续饲养 4 周.6.核酶基因 RT-PCR 分析:4 周后将犬麻醉,无菌操作下仔细游离静脉桥,取部分中段移植静脉,匀浆后按 Trizol 方法提取组织 RNA,以 0.5RNA 为起始物逆转录反应 30min,cDNA 产物 95.C 预变性 5min,95.C 变性 45S,55.C 退火 30S,72.C 延僻珥 5S,共30 个循环,72.c 延伸 10min,引物序
7、列正义链:5CCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATG3,反义链:5CAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATC,rrG3,扩增片段长 4O0bp;以 B 肌动蛋白为内参照,引物序列正义链:5GTGACGAGCTCTAGGCACCAA3,反义链:5CTCr 兀 TrGATGTCACGCACGAr 兀 TrC3,扩增产物为 382bp,取 PCR 产物经 1.6%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果并拍照.生生医生盘盘型生盟日鱼 6 堂笙 29 栅 Nn|1dh_n 塑7 静脉桥苷形态学指标观测:取静脉桥中段组织常规嘲定脱水 f 蛄包埋切片(厚度 5m)HE染色.利用计算
8、机图像分析系统测定新山膜及中膜而积8PCNA 免搜织化学分析 :取静脉桥巾段组织液氲冰冻后(厚度 5-),利用 PCNt 单克隆抗体.稀释度为 l:50.采井 jsP 法.加第一抗体 4 过夜,PBS 洗涤后 J 川八第二抗体.37F 盟育 30m 圳_PBS 洗绦 .DAB 硅色.镜 b-拧制反麻时间约 10min,常规脱水.透明封 Ji.每次宴骑均故立珥刊照(PBS 孚瘫替代一机)PCNA 阳性细胞为血符切面中膜细胞核呈浓聚的棕黄色或棕褐色片状或颗粒状.细胞增殖样度以 PCNA 指数表,定义为连续10 个高倍视野.每个批野 l00 个细胞核中阿 1 性细胞核的均百分比9 统学分析:数据均数
9、标准差()丧示,采用非配刊检验.所,f_数据统 Il 均在 SPSSII5软件卜完成.,结果I 核酶设汁和质牲构建:经汁算钆模拟分析.根据 NF-Klp65 单位 mRNA 核廿酸顺序,没计出段编码序列勾 5GfGAAACrlGATGAGTCCGTGAGGACGAAACACCTC3 的锤头状核酶,命名为R65,可以与 NF-KBp65mRNA 核酸序列中的四割位点卡 H 结合核酶与靶 RNA 作用的模式结构见图 13-CACUUUGUGUGGAO-55 一 GUOAAAACACCUC-3CAUAGAGAGGCUUACGCGOAUG卣积比值 N/M 比值亦较埘照显暂降低2678,P005),见
10、3 和 I滹道 l 錾 Jm 物.措 2B 咄 tin(382bp)泳,4 杜酶幕罔转船纽(400hp1;瑾 56HH 绀目 2 棱表竹 RTPCR 幢删结00“目肺析ILEn 镜肌 J转船组静脉新 I膛彤成十8x.3B-1 州衙内成 【钸) 80目 1 幡酶 R65l 矗物 ILun 仆栏式表 1 组静脉拼管志学比较2ltI-1CR 检测核酶同表选经核酶质粒转鞋后.移植静脉内自外源性核脯草固丧选.在 400hp的位置可明显荧光条特,而审质粒对照组未相直扩增条带(科 2)3 静脉桥 m 管形态学榆查:经棱酶 R65 转染 4周后大隐静脉平均新 ILl 膜而积(NA) 盟噍而积(MA)经榆验明显
11、低十刊绀(分刖=3787.P(0O1:2380.P005).新内膜与巾膜别 k(jl7NA(mnl)Mn对 Jm 纽 62720207069I35O45#染蛆 6n96u7lJ28J43O72O36:转_=3787.P=0I 时自耘】P=(HI3 埘 Jt 较 2678.P=003964PCNA 免疫纽织化学分析:经核酶 R65 转主:14 周后大隐静脉巾膜增殖细胞棱抗原指数 f】0%6%)与列 H 组 (34 噼I8%)比较差异有统计学意义(3098.P(005)(图 4)I,0bd0田 4 两维静忻tCN靶幢化色 nq 社H4 转鞲鲥 PE?JA 剂棱性色*004B 肌梭里标*色400.2
12、.v 一也:,讨沧同前冠状动脉旁路手术已在世外范围内广泛展开人隐静脉是最常片 J 的血管桥.其水第一年阻塞率为 15%,之后母年毁损率 I%一 491,此急需寻找一种防治移植静脉血管病的有教方法静咏血管移植后将接受动昧系统的高剪圳血流州 i 击作用,内皮细胞受损或功能异常.高表达各种细胞间赫附分子(ICAM)分泌内皮素(ET I)杖各种毙症细胞趋化 r 等,炎性细胞在局部程润并释放炎症因于;内皮 r 组织转露.激活血小板并释放血小板源,1/1 长固子 cH)技成纤维细胞生长(FGF)等细胞子.诱导巾膜滑肌细胞问质细胞增殖并 m 内膜移行.新内膜形成挺巾膜埔厚,导致静脉帆管病形成棱转录固于 F-
13、KI3 楚细胞内调控因击达的重要因子.正常情况 F.NF-kB 蛙以无插性的异一聚体 P65/p50 的形式存在 J胞质内.当细胞受到刺激时,引起 NFKB 激恬,井移位细胞棱内 .结合于基因启动了区域井诱导基因活化表达受 NF 一基固_阔控的田了包括各种黏附分子炎性细胞趋化四了,Er 一】 PDGF,FGF 等众多数病细胞因子,此类园子可促进巾膜滑肌细胞增生.新内膜彤成,I 起管腔赛车实验纠对大动物,直接采用=隐静脉作为冠脉搭桥的I【符移植物.尽 r 能模拟人冠脉搭桥的于术伞过程.将引对 NF-KBtnRNA 的棱酶牡目转染大隐静脉移植血管.来研究 R 抑制移植静脉 m 管病的作 H嚷酶 (
14、rib,lzynie)是指 -类具有催化活性的li分.它可序列特异性地结台切剖靶 RNA.抑制基因表达通过计算机程序 III 以|殳计与靶RNA 分子内的特定位.柑结合的棱酶分于序列近年来恢酶在基固清疗研究中显示出 r 阔的府前景“,旧际已将核胁应用于肿瘤治疗的临床试验本实验壤丁 NV-KBmRN核酸序列所设计的核酶 R65DNA 经质粒载休术中转动物,4 周后经 RTPCR 榆洲征赛移植静脉中有核酶 R65 基因舳表达病理学榆查发现经转染内静脉新内膜形成和中膜增厚受到明显抑制,ICNA 免疫组织化学示 PCNA 指数降低 .中膜滑肌细胞增碹受到抑制.移植静脉病的病理改变仵早期被有效阻断有报道
15、示移植静脉平滑肌增,迁移,炎性细胞浸润发生在咖管桥移植的最初 4,之后便出现经的咖符斑块 I 酵成,管壁硬化以至最终管腔狭窄塞的小可逆病变.血管内皮细胞的功能恢复可在术后4 左右逐渐完成,因此术后早埘(4 周内)抑制管壁平滑 l 仉增生迁移新内膜肜成列 f 防止移棺静肺病的发生发展关重要参考文献ITakY.suva 眦 E,K 且 w 咖 kiR.lMhmilsnnIJmof】lnhorymesandIbeirPlinvlvo:mpiddI 山 tnilofnlimgeillySliiflur1bytIvelhyb.,JnhIIlitthem1 一 x3:I145-11492PLneho!ky
16、R,BreakerRRCompulationdesignandexperlmelmldhlat1.If1l0lnhnli(hr】Mh|nlnh tN“lllioteehnol0(m523:I424-14333Akalal3EFShefidianPJLnerfetPreniingd 口 hwingraflfmlun.?Imtllnral,have“r.hAnmrlnlsu200376 一日 5q-9664LPkRL.BuaIlJ.Iqhlmion.HlsaphenousriimNlT.byp.ssuIm“1g 一h 咖“nIIl1AllllBimndElig200533:3010095Wangz
17、【. 日 MEDetmerKmAnlkappaB.rlpkamul1linbildr,k】lnj._1Pmliferalioflitlh1wI“uI5mu“1.lbJs“R .2002.102:l9B?2066BlkweljchfitIJ1hekolJerhlot-kappaBineylokieregadutlrmmJResplr(:llMf,lRIl997l7:7 伟.帆祈牛军.尊期生直甚目一 l拜基自悼棒植静 Jrf矗谴意 zr 华学杂志.2005日 534I4188huI1ns.KLumlkJllih,mymIlJI】,xyfihzmmrrjitrltlapplitlLInCtmI)nl
18、gf2O5:66758I9CiniLRslndlcSylthetiehammerheadrlJthmliI1【,.1lLmlIjJluCITIr2fd55:l_.M1o 刘垃液伟 I 村伟.等联抚梭 CD80 一兜嘘球If:触台蚩 m 息 Em 瘸坷逊迫.r 盹乐佑#杂.2005.85:34693474IIWongI)EMPERmlkaSFnjArJhIlinicIln1,Jrnrlbazyme-bntEj.illbttortBtlvBuendotheti$wthfi,rtlfnImI,rncienlwI【ITFillII1shill| 】mIr5M_CRrn20054948-955稿 I翱:2f*2编辑:R 小采
