1、曲美他嗪对心梗后心衰大鼠心功能及心肌超微结构的影响 石洁 阿不都吉力力阿不力孜 商秀洋 胡元会 中国中医科学院广安门医院 摘 要： 目的 研究曲美他嗪对心肌梗死后心衰大鼠心功能及心肌超微结构的影响。方法 采用结扎 SD 大鼠前降支复制心肌梗死后心衰模型, 以曲美他嗪于造模后 72h 灌胃给药, 以只穿线不结扎前降支为假手术组。造模后及给药 8 周后分别行心脏超声检查, 并于给药第 8 周, 于末次给药后 12h 后采集心肌样本, 行 HE 染色和Masson 染色。结果 治疗后与模型组比较, 曲美他嗪组左室舒张末内径 (LVIDd) 和左室收缩末内径 (LVIDs) 均减低, 有统计学意义 (
2、P0.05 和0.01) ;左室射血分数 (LVEF) 、左室短轴缩短率 (FS) 、心输出量 (CO) 均明显增加, 有统计学意义0.01) 。曲美他嗪组治疗后与治疗前比较, 治疗后 LVIDd 与治疗前无明显变化;治疗后 LVIDs 较治疗前减低 (P0.05) ;治疗后 EF、FS 较治疗前明显增加 (P0.01) ;治疗后 CO 较治疗前增加 (P0.05) 。光镜下观察心肌细胞, 模型组心肌梗死灶范围广泛, 内坏死组织及炎性细胞浸润, 心肌纤维排列紊乱, 梗死灶内有散在岛状分布的存活心肌细胞, 坏死心肌细胞被胶原组织代替。曲美他嗪组心肌梗死灶较局限, 心肌细胞部分坏死, 散在心肌纤维
3、断裂消失, 可见梗死灶内呈岛状分布的存活心肌细胞, 可见成纤维细胞和肉芽组织增生较模型组增多, 部分心肌细胞被胶原纤维代替。结论 曲美他嗪能有效改善心梗后心衰大鼠的收缩功能, 并改善其心肌超微结构, 抑制细胞外基质胶原纤维的增生。关键词： 心梗后心衰; 曲美他嗪; 大鼠; 心功能; 超微结构; 作者简介：商秀洋;E-mail:收稿日期：2017-04-19基金：博士后基金 (201104224) Effects of Trimetazidine on the Cardiac Function and Ultrastructure in Rats with Heart Failure after
4、 Myocardial InfarctionShi Jie Abudujilili Shang Xiuyang Hu Yuanhui Guanganmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences; Abstract： Objective To study the effect of trimetazidine on cardiac function and ultrastructure in heart failure rats after myocardial infarction.Methods Ligation of lef
5、t anterior descending coronary artery was performed in myocardial infarction-induced heart failure models in rats.Rats were randomly divided into sham group, model group and trimetadizine group after the success of building.Echcardiography was used to observe cardiac function changes of rats.Hematox
6、ylin-Eosin (HE) staining and Masson staining were used to observe histopathologic changes of myocardial tissue under light microscope.Results Compared with the rats in model group, left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and systole (LVIDs) in trimetadizine group were significantly re
7、duced after 8 weeks drug therapy.The ejection fraction (LVEF) , fractional shortening (FS) and cardiac output (CO) in trimetadizine group were increased obviously.Under light microscope, HE staining showed that there was wide range of myocardial infarction and disordered arrangement of myocardial fi
8、bers in model group cells.A lot of collagen fibre tissues were seen, while granulation tissue rared.In trimetadizine group, there was limited myocardial infarctions area.Myocardial fiber arrangement was irregular.Fibroblast and granylation tissue hyperplasia increased more than model group.Masson st
9、aining showed that myocardial cell were hypertrophied, arranged disorderly, and some were supplemented by collagen tissues in model group.The partial myocardial cells were replaced by collagen fibers and collagen fibers were mingled with myocardial cells in trimetadizine group.Conclusion Trimetazidi
10、ne can effectively improve the contractile function of heart failure rats after myocardial infarction, and improve myocardial ultrastructure and inhibit the proliferation of extracellular matrix collagen fibers.Keyword： heart failure after myocardial infarction; trimetazidine; rats; cardiac function
11、; ultrastructure; Received： 2017-04-19目前缺血性心脏病的治疗取得了很大的进展, 但是心衰作为各种心血管疾病的终末期表现, 仍是心血管疾病高病死率和高致残率的主要原因。曲美他嗪作为一种新型的心肌代谢类药物, 无论动物实验和临床试验均表明其对急、慢性心肌缺血有保护作用。本研究旨在评价曲美他嗪对心肌梗死后心衰大鼠心功能及心肌超微结构的影响。1 资料与方法1.1 动物健康雄性 SD 大鼠 50 只 (体重 200g250g) , 购自北京维通利华实验动物有限公司许可证号:SCXK (京) 2012-0001, 由中国中医科学院广安门医院伦理委员会监督。分笼饲养于中
12、国中医科学院广安门医院 SPF 级动物房, 自然光照, 饲以标准的大鼠合成饲料, 自由饮用纯净水, 环境温度 (252) , 相对湿度 (45%70) %。1.2 仪器HP 5500 彩色多普勒超声显像仪 (PHIL-IPS, America) ;HX-200 动物呼吸机 (成都泰盟科技有限公司, 中国) ;BL-820S 生物机能实验系统 (成都泰盟科技有限公司, 中国) ;SIM-F124 制冰机 (SANYO, Japan) ;MLS-3750 高压蒸汽灭菌器 (SANYO, Japan) ;BA110S 千分位电子天平 (Sartorius AG, German) ;ASP200S 脱
13、水机 (Leica, German) ;EG1150H 包埋机 (Leica, German) ;RM2245 切片机 (Leica, German) ;IX70 光学显微镜 (OLYPUS, Japan) 无菌手术器械 (弯钳, 镊子, 弯镊, 持针器, 眼科剪, 38 圆针, 6-0 线, 1 号缝合线) 和载玻片、PV 管。1.3 药物与试剂1.3.1 药物曲美他嗪片 (远大医药有限公司, 中国, 批号:12070404) ;戊巴比妥粉剂 (上海艾研生物有限公司, 中国, 批号:081130251) ;注射用青霉素钠 (华北制药股份有限公司, 中国, 批号:H13020657) 。1.3
14、.2 试剂10%中性甲醛 (北京世济合力生物科技有限公司, 中国, 生产日期:2013 年 6 月3 日) ;伊红染液 (珠海贝索生物技术有限公司, 中国, 批号:713051) ;苏木素体细胞染色液 (福州迈新生物技术开发有限公司, 中国, 批号:130604445H) ;苏木色精返蓝液 (北京世济合力生物科技有限公司, 中国, 生产日期:2013 年6 月 3 日) ;苏木色精分色液 (北京世济合力生物科技有限公司, 中国, 生产日期:2013 年 6 月 3 日) ;Masson 三色染色液 (珠海贝索生物技术有限公司, 中国, 批号:YZB/粤珠 0011-2013) 。1.4 动物模
15、型制备SD 大鼠以 2%戊巴比妥液 (40mg/kg 体重) 进行腹腔麻醉1, 仰卧位固定于大鼠台上, 胸部、颈部手术视野区常规备皮、消毒, 同时记录标准肢体导联心电图;颈部手术视野区沿气管方向作长约 3cm 左右的纵行切口, 逐步分离颈部肌肉, 暴露气管, 采用内直径 3 mm 的气管导管经大鼠口腔插入气管内, 以无创缝合线将导管打结固定于大鼠下颚, 气管一端连接 HX-200 动物呼吸机, 辅助大鼠呼吸 (呼吸机潮气量为 (912) mL, 频率 (8590) 次/min, 吸呼比为 12) ;在距胸骨左缘 0.5cm, 第 34 肋骨间作长 3cm 的纵形切口, 从左侧第四肋间钝性分离皮
16、肤、胸大肌, 打开胸腔, 用眼科开睑器拉开第 3、4 肋, 显示手术视野, 暴露心脏, 剪开心包, 在肺动脉圆锥与左心耳交界下 (12) mm 处用 38 圆针穿过, 用 6-0 无创性缝线, 结扎冠状动脉左前降支 (LAD) , 以穿刺而未结扎大鼠作为假手术组;以结扎部位远端心肌变白、搏动减弱且心电图出现 ST 段弓背向上明显抬高为急性心肌梗死 (AMI) 造模成功标志。然后挤出胸腔内气体, 缝合外皮, 碘伏消毒;术后连续 3d 注射 20 万单位青霉素抗感染。1.5 分组及给药动物购回后在 SPF 级动物房适应性喂养 3d 进入实验;术前每只大鼠进行超声心动检测;术前禁食 12h 后, 体
17、重均衡, 随机分为造模组与假手术组。假手术组16 只和造模组 34 只;造模组大鼠按本文 1.4 所述方法造模, 术后大鼠复苏 24h后行超声心动检测, 左室射血分数 (LVEF) 值较手术前下降大于 15%判定为心力衰竭模型复制成功;造模成功大鼠以随机数字表法分为模型组、曲美他嗪组。各组大鼠术后 72h 开始灌胃给药, 模型组和假手术组给予生理盐水 4 ml/kg;曲美他嗪组给予曲美他嗪 10 mg/kg 溶于生理盐水灌胃。各组连续给药 8 周, 每天1 次, 于每日 09:00-10:00 间灌胃给药, 以 5mL 注射器连接灌胃针给大鼠灌胃;每周称量体重 1 次, 根据体重计算调整给药剂
18、量。1.6 大鼠心功能检测大鼠分别于术前、术后 24h 及药物干预后 8 周行超声心动检测。大鼠称重并以2%戊巴比妥液 (40mg/kg 体重) 腹腔麻醉, 大鼠左胸前广泛备皮后, 仰卧位固定, 选取标准左室乳头肌短轴切面和左室长轴切面结合 M 型和多普勒超声进行检查 (CL15-7 高频线阵探头、7 MHz15 MHz) , 探头置于其左胸, 在取得较理想的胸骨旁左心室短轴二维图像后, 在乳头肌水平将 M 型取样线垂直室间隔和左心室后壁获得 M 型超声心动图, 测定左室舒张末期内径 (LVIDd) 、左室收缩末期内径 (LVIDs) , 并计算出 LVEF、左室短轴缩短率 (FS) 和心输出
19、量 (CO) 。计算由超声机自动完成。所检测数据均测量 3 次以取其平均值。超声检查的操作及分析由不知晓大鼠分组情况的超声专科医生完成。1.7 大鼠心肌样本取材各组大鼠于给药第 8 周, 于末次给药后 12h 后采集心肌样本, 每组随机采集 6例心肌样本。大鼠麻醉后, 迅速打开胸腔, 剪开心包, 剔除附属物。心脏经生理盐水溶液反复冲洗至溶液变清亮, 心脏浸入 10%中性甲醛溶液室温固定。1.8 大鼠心肌样本制备1.8.1 大鼠心肌组织 HE 染色从 10%中性甲醛溶液中取出心脏, 修整组织, 经横断切面取出左室中部组织块, 放入包埋盒中, 置入脱水机中脱水, 然后常规石蜡包埋。之后经修片、切片
20、、裱片、烤片结束之后, 即可进行染色、封片。1.8.2 大鼠心肌组织 Masson 染色充分固定和脱蜡后于玻片心肌组织移入 Bouin 氏液或 Zenker 氏液, 流水冲洗过夜, 常规脱水包埋;切片脱蜡至水;Weigert 铁苏木素 (Weigert 铁苏木素 A、B液等比例混合液) 染 (510) min, 流水稍洗;1%盐酸酒精分化, 流水冲洗数分钟;丽春红酸性品红染液染 (530) min, 1%冰醋酸冲洗;磷钼酸溶液处理约5min 后弃掉, 不用水洗直接用苯胺蓝染液复染 5min;1%冰醋酸处理 1min, 快速用 95%酒精脱水多次;无水酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封固。1.
21、9 统计学处理采用 SPSS17.0 软件进行统计分析。组内前后对照采用配对资料 t 检验。各组间比较采用单因素方差分析, 各组间两两比较时先进行 Levene 方差齐性检验, 满足方差齐性时采用 LSD-t 检验进行, 不满足方差齐性采用 Dunnetts-t 检验。假设检验标准以 P0.05 为具有统计学意义。2 结果2.1 模型复制及分组实验 SD 大鼠共计 50 只, 随机分为假手术组 16 只, 造模组 34 只。假手术组手术后存活 13 只, 给药期间无死亡;造模组复制模型成功 28 只, 以随机数字表法, 随机分为模型组 14 只、曲美他嗪组 14 只;给药期间, 模型组死亡 2
22、 只, 曲美他嗪组死亡 2 只。2.2 曲美他嗪对心梗后心衰大鼠心功能的影响治疗后与模型组比较, 曲美他嗪组左室舒张末内径和左室收缩末内径均减低, 有统计学意义 (P0.0 5 或 P0.01) ;LVEF、FS、CO 均明显增加, 有统计学意义 (P0.01) 。曲美他嗪组治疗后与治疗前比较, 治疗后 LVIDd 与疗前无明显变化;治疗后LVIDs 较治疗前减低, 有统计学意义 (P0.05) ;治疗后 LVEF、FS 较治疗前明显增加, 有统计学意义 (P0.01) ;治疗后 CO 较治疗前增加, 有统计学意义 (P0.05) 。详见表 1。表 1 各组大鼠心功能参数比较 (s) 下载原表
23、 2.3 曲美他嗪对心梗后心衰大鼠心肌组织超微结构的影响2.3.1 HE 染色假手术组光镜下心肌细胞形态基本正常, 胞质、胞核清晰, 可见清晰的心内膜层、肌层和外膜层。心肌细胞核呈椭圆形, 胞浆内肌丝排列整齐, 心肌纤维着色均匀 (见图 1) 。模型组光镜下心肌梗死灶广泛分布, 梗死灶内可见坏死组织及炎性细胞浸润, 胞浆嗜酸性变, 红染似肌凝状态;心肌纤维排列紊乱, 部分心肌纤维断裂, 呈灶性坏死, 细胞核消失, 可见大量胶原纤维组织, 梗死灶内有散在岛状分布的存活心肌细胞, 成纤维细胞稀少, 肉芽组织生长稀少 (见图2) 。曲美他嗪组光镜下心肌梗死灶较局限, 心肌细胞部分坏死, 心肌纤维排列
24、不整齐, 散在心肌纤维断裂消失, 可见梗死灶内呈岛状分布的存活心肌细胞, 炎性细胞浸润较模型组减少。可见成纤维细胞和肉芽组织增生较模型组增多 (见图 3) 。2.3.2 Masson 染色假手术组心肌细胞质、肌纤维呈红色, 细胞核呈蓝褐色, 胶原纤维呈蓝色。可见心肌细胞排列整齐, 正常心肌组织小动脉周围及心肌细胞间隙有少许胶原纤维 (见图 4) 。模型组在梗死灶及周边, 可见坏死心肌细胞被胶原组织代替。可见心肌细胞肥大、排列紊乱, 心肌组织小动脉周围有较多胶原沉积, 并有向心肌细胞间隙伸展的趋势。心肌组织间隙的胶原沉积也显著增加 (见图 5) 。曲美他嗪组大鼠心肌细胞形态学观察:可见部分心肌细
25、胞被胶原纤维代替, 胶原纤维与心肌细胞相间 (见图 6) 。图 1 假手术组心肌组织形态学 (8 周 HE100) 下载原图图 2 模型组心肌组织形态学 (8 周 HE100) 下载原图图 3 曲美他嗪组心肌组织形态学 (8 周 HE100) 下载原图图 4 假手术组心肌组织形态学 (8 周 Masson100) 下载原图图 5 模型组心肌组织形态学 (8 周 Masson100) 下载原图图 6 曲美他嗪组心肌组织形态学 (8 周 Masson100) 下载原图3 讨论曲美他嗪作为一种心血管病治疗的辅助药物, 由于其特有的优化心肌能量代谢的药理机制, 目前主要用于心肌缺血和心功能不全的辅助治
26、疗。正常心肌的能量主要来源于葡萄糖和脂肪酸氧化代谢。脂肪酸氧化代谢产生等量 ATP 的耗氧量比糖代谢高, 因此其产生 ATP 的效率低于糖代谢。当心肌缺血时, 冠脉血循环中的脂肪酸升高, 心肌能量代谢以脂肪酸代谢为主, 葡萄糖氧化代谢受阻, 不但会使耗氧增加, 还使糖酵解的产物如乳酸增加。曲美他嗪通过抑制心肌能量代谢中的脂肪酸氧化, 使之向葡萄糖氧化转化, 提高 ATP 生成的效率, 达到改善心肌缺血和心功能的作用。本研究中, 与心梗后心衰模型组相比较, 曲美他嗪组可以明显减小心衰后扩大的左室收缩末内径和舒张末内径, 尤其减小左室收缩末内径, 提高左室射血分数和左室短轴缩短率, 提高心输出量,
27、 改善心梗后心衰大鼠的心脏收缩功能, 这与以往的研究结果相符2。这除了曲美他嗪影响心肌细胞代谢以外, 可能还有其他的机制参与其中, 如 (1) 曲美他嗪通过改善缺血细胞内的能量代谢, 减少细胞内 H、Na、Ca 的超负荷, 抑制氧自由基的生成, 提高氧自由基的清除功能, 减少细胞膜的脂质氧化, 而具有强大的抗氧化作用3。 (2) 在缺氧状态下, 线粒体内 Ca 超负荷可以引起线粒体肿胀, 氧化磷酸化障碍, 曲美他嗪可以与膜上的可通透性蛋白结合并使之失活以抑制 Ca 引起的线粒体肿胀, 从而减少凋亡蛋白细胞色素 C 释放, 抑制下游的 caspase 酶, 阻止细胞凋亡4-5。心功能的改善依赖于
28、心肌细胞的存活。本研究中, 模型组心肌梗死灶内可见坏死组织及炎性细胞浸润;心肌纤维排列紊乱, 部分心肌纤维断裂, 呈灶性坏死, 细胞核消失, 梗死灶内有散在岛状分布的存活心肌细胞, 肉芽组织生长稀少。在梗死灶及周边, 可见坏死心肌细胞被胶原组织代替。曲美他嗪组心肌梗死灶较局限, 心肌细胞部分坏死, 散在心肌纤维断裂消失, 可见梗死灶内呈岛状分布的存活心肌细胞, 成纤维细胞和肉芽组织增生较模型组增多, 部分心肌细胞被胶原纤维代替, 胶原纤维与心肌细胞相间。提示曲美他嗪可能有抑制心梗后心肌细胞凋亡、改善心肌纤维化的作用。这与之前的研究结果相一致6-7。曲美他嗪作为一种优化心肌代谢的药物, 在不影响
29、心率、血压的情况下, 通过优化心肌的能量代谢而改善心室的收缩功能、抑制氧化应激反应而阻止心肌细胞凋亡, 对心梗后心衰大鼠的心功能和心肌超微结构产生有益的影响。其临床疗效也逐渐得到证实, 在心绞痛、心力衰竭、心肌再灌注损伤等方面都有一定的治疗作用。参考文献1Pfeffer MA, Braunwald E.Ventricular remodelling after myocardial infarction:experimental observations and clinical implicationsJ.Circulation, 1990, 81:1161-1172. 2李兵, 陈相健,
30、朱舒舒, 等.曲美他嗪对慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢及超微结构的影响J.中华老年心脑血管病杂志, 2008, 10 (6) :447-450. 3张锐, 韦建瑞, 尹海燕, 等.曲美他嗪对休克患者肾功能影响的临床研究J.中华危重症急救医学, 2014, 26 (1) :219-222. 4Gong X, Fan G, Wang W, et.al.Trimetazidine protects umbilical cord mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation induced apoptosis by activa
31、tion of aktJ.Cell Physiol Biochem, 2014, 34:2245-2255. 5Singh D, Chopra K, RETRACTED:Effect of trimetazidine on renal ischemia/reperfusion injury in ratsJ.Pharmacological Research, 2004, 50:623-629. 6Xu H, Zhu G, Tian Y.Protective effects of trimetazidine on bone marrow mesenchymal stem cells viability in an ex vivo model of hypoxia and in vivo model of locally myocardial ischemiaJ.J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci, 2012, 32:36-41. 7冯翔宇, 李彤, 李秀华, 等.曲美他嗪与雷米普利对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3 的影响J.中华老年心脑血管病杂志, 2014, 16:856-859.
