1、荧光定量聚合酶链式反应确诊血清单纯CMV-IgG阳性新生儿先天性巨细胞病毒感染的经济学评价基金资助项目：重庆市科委基金项目（CSTC,2009BB5269）；重庆医科大学科研基金（XBYB2008040）Supported by Natural Science Foundation Project of CQ CSTC(2009BB5269) ,the Science Foundation Project of Chong Qing Medical University (XBYB2008040).作者简介：李禄全，男，1975年生，四川西昌人，主治医师，讲师，主要从事新生儿脑损伤疾病研究，
2、电话：13678433408，E-mail:liluquan456李禄全1 余加林 1 谭俊杰2 重庆医科大学附属儿童医院 重庆，400014 1、新生儿诊治中心，2、临床分子医学中心摘要 目的: 探讨采用荧光定量聚合酶链式反应确诊血清单纯CMV-IgG阳性新生儿为先天性巨细胞病毒感染的经济学成本，为大规模开展流行病学调查的费用效果分析提供依据。方法: 对本新生儿诊治中心2008年3月至2009年2月住院的日龄在14天以内的新生儿进行前瞻性研究，所有患儿均采用酶联免疫吸附法检测血清血清CMV抗体，对于CMV-IgM或IgG阳性的新生儿进一步用荧光定量聚合酶链式反应(Fluorescent Qu
3、antitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)检测其尿液CMV病毒含量，并分析确诊一例CMV感染病例的费用。结果：研究期间共检测新生儿610例，CMV-IgM阳性35例，FQ-PCR也为阳性为15例，阳性率为42.9%；单纯IgG阳性547例中FQ-PCR也为阳性为16例，阳性率为2.93%；IgM 及 IgG均为阴性共28例，无一例FQ-PCR为阳性。对于CMV-IgM 阳性病例 ，确诊先天性CMV感染的费用为256元/例，而单纯IgG阳性病例，确诊费用为3760元/例。结论：FQ-PCR确诊单纯CMV-IgG阳性之新生儿先天性CMV感染费用效果极高
4、，不适用于大规模流行病学调查。关键词：巨细胞病毒， 新生儿，先天性感染， 酶联免疫吸附法，荧光定量聚合酶链式反应Economic evaluation for fluorescent quantitative polymerase chain reaction diagnosis confirmed congenital cytomegatovirus infection in neonate with single positive of CMV-IgG Lu-Quan Li *M.D 1, Jia-Lin Yu M.D,PhD1 ,Jun-Jie Tan M.D 2 1.Neonatal
5、Diagnosis and Treatment Center，2.Clinical Molecular Medicine Center. Childrens Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014, P.R. ChinaAbstract Objective: To explore the Cost-effectiveness of fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) diagnosis confirmed congenital cyt
6、omegatovirus infection in neonate with positive of CMV-IgG. Methods : An perspective study was performed to all neonates less than 14 days ages,who were charged in Neonatal Diagnosis and Treatment Center ,Childrens Hospital of Chongqing Medical University from March 2003 to Feburary 2009. Serum cyto
7、megatovirus immunoglobulin M (CMV-IgM) or CMV-IgG were detected by Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) in all neonates .CMV-DNA were detected by FQ-PCR. The cost-effectiveness analysis were also performed . Result : Six hundred and ten neonates were detected by ELISA and FQ-PCR ,35 neonates wi
8、th positive of CMV-IgM ,the positive rate of FQ-PCR in these infants were 42.9% (15/35). positive of single CMV-IgG in 547 neonates , the positive rate of FQ-PCR were 2.93% (16/547) . CMV DNA were not detected in neonates with negative of both CMV-IgM and IgG (0/28) . The cost-effectiveness of diagn
9、osis confirmed congenital cytomegatovirus infection were 256 RMB / percent in infants with positive of CMV-IgM, however , 3760RMB/percent in neonates with positive of single CMV-IgG . Conclusion : the The Cost-effectiveness of diagnosis confirmed congenital cytomegatovirus infection were sever high
10、for neonates with positive of single CMV-IgG by FQ-PCR. It was not suitable method for large scale epidemiological survey Key words : Cytomegatovirus , Neonate , congenital infection , Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay , Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction先天性巨细胞病毒（cytomegatovirus，CMV）
11、感染是指由于母亲在怀孕期间感染CMV，垂直传播导致胎儿感染CMV，引起胎儿或新生儿多器官损害的感染性疾病。府伟灵等1大样本报道重庆地区正常育龄妇女感染率为3.01% ，异常妊娠史妇女为11.76%，而孕妇原发感染CMV后，垂直传播率高达32%-40%2，3，提示由于垂直传播而导致先天性CMV感染可能具有较高的发病率。由于先天性CMV感染对新生儿的影响极大，但90的先天性CMV感染的新生儿出生时无症状，在生长发育过程中，逐渐表现出脑瘫、耳聋等神经系统后遗症4。因此，开展大规模的先天性CMV感染的流行病学调查，早期发现先天性CMV感染显得尤为重要。酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Imm
12、unoSorbent Assay,ELISA)检测方法简便、快速、对设备及技术人员要求不高，国内目前最常用该法检测血清CMV抗体，但该检测方法检测得到的CMV-IgG抗体既有可能来自母体胎传，也有可能是胎儿或新生儿自身受CMV感染后产生，需要进一步采用其他方法来确诊。目前可采用荧光定量聚合酶链式反应(Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reactio,FQ-PCR)检测病毒含量的方法来确诊先天性CMV感染5。对于CMV-IgG阳性新生儿是否适用FQ-PCR进行大规模的流行病学调查，其费用-效果如何？国内少有研究。本研究旨在前瞻性探讨FQ-PCR确
13、诊血清单纯CMV-IgG阳性新生儿先天性CMV感染的经济学成本,为大规模开展流行病学调查的费用效果分析提供依据。1、 研究对象 2008年3月至2009年2月重庆医科大学儿童医院新生儿诊治中心收治的日龄在14天以内的所有新生儿为研究对象，所有进行FQ-PCR检测的新生儿均具备由患儿家长签署的知情同意书，本研究获得重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会批准(批准文号：2008006)及中国临床试验注册中心注册，编号(ChiCTR-OCC-00000489)。2、 研究方法 2.1 ELISA检测法 所有新生儿入院时无论有无先天性CMV感染的危险因素及表现，均即刻采集静脉血2ml 送临床检验中心采用E
14、LISA法初步检测CMV感染情况，检测方法参照试剂盒操作说明完成，并逐月进行质量控制检测。2.2 FQ-PCR检测方法 对于ELISA法初步检测结果为CMV-IgM或IgG阳性的新生儿采集其尿液5ml进一步用FQ-PCR检测确诊是否存在CMV感染，对于部分CMV-IgM及IgG均为阴性的新生儿，其父母要求进一步检测有无CMV感染，也采集其尿液送检。选用CMV AD169株基因组中编码即刻早期转录调节蛋白的IE1基因的一段高度保守的非编码区为扩增靶序列，长度86bp。上游引物：5-TGGGCTAACTATGCAGAGCA-3，下游引物：5-AGCCATFGGTGGTCTFAGGG-3。PCR反应
15、中，利用Taq酶5-3外切酶活性将荧光探针切断，通过荧光值的变化，利用阳性标准品制成的标准曲线进行定量。反应体系50l，同时设置不加模板的阴性对照。扩增条件：93 2 min，93 45 s，55 1 min，10个循环，93 30 s，55 45 s，30个循环。电脑对整个PCR反应过程中荧光量进行实时检测，反应结束时自动绘制出每个被检对象的PCR扩增曲线，通过与标准品的扩增曲线比较进行定量。FQ-PCR检测方法逐月进行质量控制检测。2.3 统计学分析 所有数据输入SPSS13.0统计软件，并进行资料正态性分布检验。病毒含量数据先进行log对数转换，计量资料以均数标准差 (xS)表示，并进行
16、随机样本t检验，计数资料采用卡方检验，p 0.05 认为差异有显著性意义。3、 结果3.1 ELISA检测法及FQ-PCR检测结果 剔除所有仅进行ELISA检测法检测但未进行FQ-PCR检测的病例，纳入统计对象共610例新生儿，其中男377例，女233例，单纯CMV-IgM阳性17例；IgM 及 IgG均为阳性18例；单纯IgG阳性547例；IgM 及 IgG均为阴性共28例。IgM 阳性35例中FQ-PCR也为阳性为15例，阳性率为42.9%；单纯IgG阳性547例中FQ-PCR也为阳性为16例，阳性率为2.93%；IgM 及 IgG均为阴性的28例中，无一例FQ-PCR为阳性。3.2 血清
17、CMV-IgM阳性和CMV-IgG阳性组DNA拷贝数比较 CMV-IgM阳性组CMV DNA拷贝数在5.40103 1.67108 之间；单纯CMV-IgG阳性组HCMV DNA拷贝数在7.13102 7.58105之间，二组尿液CMV DNA拷贝数对数值log转换，并进行正态性分布检验，数据符合正态性分布，CMV-IgM阳性组患儿尿液CMV DNA拷贝数分布在较高水平(见图1)。CMV-IgM阳性组CMV DNA均值为5.7941.24，单纯CMV-IgG阳性组为4.110.87，两组比较差异有显著性意义（t =4.395，p 0.001） 图1 CMV-IgM阳性组与CMV-IgG阳性组C
18、MV DNA拷贝数比较3.3 费用效果分析 ELISA检测法成本为33元人民币/样本，FQ-PCR检测成本为110元人民币/样本。在本研究中， CMV-IgM 阳性35例中FQ-PCR也为阳性为15例，确诊先天性CMV感染的费用为35110/15= 256元/例，而单纯IgG阳性547例中FQ-PCR为阳性为16例，费用为547110/16= 3760元/例，而IgM 及 IgG均为阴性的28例中，无一例FQ-PCR为阳性。提示在流行病学调查中，对单纯CMV-IgG 阳性或CMV-IgM 和CMV-IgG均为阴性病例进一步检测FQ-PCR，其费用效果远远高于CMV-IgM 阳性病例，将导致极大
19、的医疗资源的浪费。4、 讨论先天性感染指CMV 感染母亲所生的子女于生后14 d内(含l4 d)证实有CMV感染，为宫内感染所致6。CMV感染后刺激机体产生特异性IgG、IgM等抗体，血清学诊断的常用方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，通过检测血清中的这些抗体可间接证实体内CMV的存在。研究表明我国为CMV感染的高发国家，国内一项对31165例育龄妇女血清进行CMV检测结果显示CMV-IgM抗体阳性率为5.41；HCMV-IgG抗体阳性率高达71.567。由于CMV-IgG可以通过胎盘屏障垂直传给胎儿，在新生儿体内检测CMV-IgG阳性率较高，诊断新生儿先天性CMV感染需排除从母体被动获得的特
20、异性IgG，因此，对于CMV-IgG阳性的新生儿需要通过其他方法来尽快明确有无先天性CMV感染，为早期治疗争取时间。FQ-PCR是目前最为准确和快速的微生物定量方法 ，能更早检测到病毒感染，CMV感染后，局部排毒量与机体内病毒量密切相关，检测尿中HCMV量可很好反映机体内HCMV病毒量 ，且取材方便、无创、易为家长接受。鉴于CMV-IgG容易透过胎盘屏障，在新生儿体内具有较高的CMV-IgG阳性率，对于这部分新生儿是否适用FQ-PCR进行大规模流行病学调查，其经济学成本如何值得研究。由于本研究人群的年龄的特殊性是在生后14天以内，CMV抗体的产生有一段“窗口期”，由于IgM抗体产生本身具有滞后
21、性，当患者被病原体感染约2周后IgM抗体才能达到被检测到的水平，而IgG抗体的产生还在IgM抗体之后5。本研究发现单纯血清IgG阳性547例中FQ-PCR为阳性仅16例，阳性率仅为2.93%；提示绝大部分的CMV-IgG抗体是来自于其母亲，确诊单纯IgG抗体阳性新生儿为先天性CMV感染的费用高达3760元/例。因此，我们认为在大规模的流行病学调查中，对于单纯CMV-IgG抗体阳性的新生儿采用FQ-PCR进一步检测有无CMV感染的成本极高，不适于常规开展。鉴于在本研究中，的确有2.93%的单纯血清IgG阳性新生儿确诊为先天性CMV感染，而先天性CMV感染将导致：（1）妊妇出现习惯性流，死胎、死产
22、；（2）在胚胎发育期胎儿各器官发育形态及功能异常，如：皮肤瘀斑、小头畸形、生长迟缓、脑积水、脉络膜视网膜炎等；（3）早产、低出生体重、难以用其他疾病解释的肝脾肿大、凝血功能异常等。我们认为对于存在上述危险因素的新生儿，其血清单纯CMV-IgG抗体阳性，也有指针采用FQ-PCR早期明确有无先天性CMV感染。无上述表现的新生儿，其血清单纯CMV-IgG抗体阳性，我们认为在大规模流行病学调研的策略中，更适合于用ELISA法定期动态随访其血清CMV抗体水平。与单纯CMV-IgG抗体阳性组不同，本研究中IgM 阳性35例中FQ-PCR也为阳性为15例，阳性率为42.9%；与国内其他学者研究结果相似5，C
23、MV DNA拷贝数较单纯CMV-IgG抗体阳性组高（图1），提示CMV-IgM阳性病例病毒含量处于高水平，更容易检测到CMV DNA，同时CMV-IgM阳性表明活动性感染，如同时抗CMV-IgG阴性，则表明为原发性感染6，对于早期拟定CMV的治疗方案具有重要意义，因此，对于CMV-IgM阳性的新生儿可反复采用FQ-PCR检测尿液CMV DNA。本研究中，CMV-IgM阳性新生儿确诊先天性CMV感染的费用为256元/例，远低于血清单纯CMV-IgG阳性者(3760元/例)，因此，在大规模的流行病学调研中，FQ-PCR法适用对象应当是CMV-IgM阳性新生儿。综上所述，我们认为FQ-PCR确诊单纯
24、CMV-IgG阳性之新生儿先天性CMV感染费用效果极高，除存在“特定危险因素”的新生儿外，不适用于发展中国家大规模流行病学调研；FQ-PCR法适用于CMV-IgM阳性的新生儿的大规模流行病学调查。参考文献1、 匡红,府伟灵，曹利. 重庆地区2067例育龄妇女TORCH感染的调查研究.中华医院感染学杂,2006;16(11):1254-1256.2、 Kenneson A, Cannon MJ. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. Rev Med V
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