1、抗幽门螺杆菌黏附素 A 卵黄抗体的制备及评估 曾波 张忠宝 张智 孙礼进 陈咏梅 曹谦 钱颖 李再新 四川理工学院化学工程学院 四川理工学院生物工程学院 摘 要： 目的 制备及评估一种以幽门螺杆菌黏附素 A (HpaA) 为靶点的特异性卵黄抗体。方法 脲酶阳性胃黏膜样本采自富顺县人民医院, 微需氧条件下分离培养幽门螺杆菌;PCR 扩增 HpaA 片段, 原核表达形式获得 HpaA 重组蛋白并以 Western blot检测其抗原性;与弗氏佐剂充分乳化后免疫产蛋鸡, 水稀释-盐析法纯化卵黄抗体;SDS-PAGE、ELISA 及 Dot blot 分析其生物学特性并评估对分离株体外生长的抑制效果。
2、结果 分离株脲酶、氧化酶、触酶反应阳性;HpaA 片段长 702 bp, 重组 HpaA 蛋白相对分子质量约为 45 000, 可溶形式表达且具有良好的抗原性;以其制备的 IgY-HpaA 滴度高达 1150 000, 11 000 稀释后仍能良好地识别分离株, 5 mg/ml 剂量可显著抑制分离株的生长。结论 以 HpaA 为靶点制备的卵黄抗体在体外可特异性识别并抑制幽门螺杆菌的生长。关键词： 幽门螺杆菌; 黏附素 A; 卵黄抗体; 原核表达; 抑菌效果; 作者简介：李再新, E-mail:收稿日期：2017-08-18基金：四川省科技厅人才创新计划 (2017RZ0083) Prepara
3、tion and characterization of specific IgY against Helicobacter pylori adhesin AZENG Bo ZHANG Zhongbao ZHANG Zhi SUN Lijin CHEN Yongmei CAO Qian QIAN Ying LI Zaixin School of Chemical Engineering, Sichuan University of Science Department of Biological Engineering, Sichuan University of Science Abstra
4、ct： Helicobacter pylori (Hp) is known as the main cause of gastritis disorder, but traditional antibiotic therapy against Hp infection is challenged by the increasing tolerance.A high-targeted egg yolk antibody (IgY) has expected to be a mean of passive immunization therapy for Hp infections.Here, a
5、 specific IgY targeting to Hp adhesion-A (IgY-HpaA) was prepared and evaluated.In brief, a urease-, oxidase-, catalase-positive strain was isolated from a suspected Hp infected patient, and hpa A partial gene (702 bp) was amplified from the isolated strain using PCR reaction with a specific primer.R
6、ecombinant HpaA protein, molecular weight is about 45 KDa, was expressed as soluble protein in the E.coli prokaryotic expression system and then purified from supernatant through Ni2+-NTA affinity chromatography, and its antigenicity was identified by Western blotting with anti-Hp IgY.Anti-HpaA vacc
7、ine was prepared from the emulsion of r HpaA protein with the same volume of Freunds adjuvant.7 days after immunizing chickens, IgY-HpaA was extracted from yolk using water dilution and sodium chloride precipitation.The purity and titer of IgY-HpaA, evaluated by SDS-PAGE and ELISA, reached to 95% an
8、d 1150 000 respectively.A specific recognition of IgY-HpaA to Hp still been detected although diluted by 1 000 times.Remarkably, the growth of Hp can be suppressed significantly by IgY-HpaA at 5 mg/ml in vitro.In summary, the prepared IgY-HpaA possesses a high specificrecognition and growth inhibiti
9、on to Hp in vitro.Keyword： Helicobacter pylori; Adhesion A; Egg yolk antibody; Prokaryotic expression Antibacterial effect; Received： 2017-08-18幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori, Hp) 是一种寄生于胃黏膜层的革兰氏阴性细菌1, 直接参与了慢性胃炎、胃溃疡的发生与发展, 是胃腺癌、胃黏膜相关淋巴样组织 (MALT) 淋巴瘤的潜在诱发因子2-3。据统计, 全球近一半的人群患有 Hp 感染, 我国自然人群中 Hp 的感染率高达 56%4
10、-5。目前, 临床上主要以阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑及奥美拉唑等抗菌药物的联合使用治疗 Hp 的感染6, 但“三联”或“四联”疗法易引起恶心、食欲不振等不良反应7;治疗过程中出现的适应性耐药以及根除失败后引起的获得性耐药等问题越来越严重8;此外, 多种抗生素联用破坏了消化道菌群 (特别是肠道菌群) 的正常结构, 易引起腹泻、消化不良等症状9。卵黄抗体是禽类卵黄中靶向性强、副作用低、无耐药性的免疫球蛋白, 在病毒性腹泻、胃肠道疾病治疗和消毒防御等方面有着较为普遍的应用, 并作为一种新的被动免疫疗法用于预防和治疗 Hp 感染10-11。Hpa A (Helicobacter pylori adhe
11、sion A) 是 Hp 黏附素群的核心成分, 对 Hp体内定植具有极为重要的意义12。Hp 感染者血清中 Hpa A 抗体的检出率高达86%, 显著高于热休克蛋白 (68%) 和细胞空泡毒素 (68%) 13。本研究通过从临床上分离出 1 株野生型 Hp (WT-Hp) , 经体外重组及免疫学技术获得了可高特异性识别 Hp 且抑菌效果显著的抗 Hpa A 卵黄抗体, 为进一步探讨抗 Hpa A 卵黄抗体对于 Hp 体内清除的临床可实现性奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂Columbia 培养基 (山东西亚试剂) ;Hp 培养基添加剂 (含 1 mg/ml 万古霉素, 2 mg/ml
12、 甲氧苄啶, 0.5 mg/ml 两性霉素 B, 1 mg/ml 头孢磺啶) 和氧化酶试纸 (青岛海博生物) ;微需氧产生装置 (美国 Gene Science) ;基因组抽提试剂盒 (德国 QIAgen) ;硝酸纤维素膜 (美国 Millipore) ;二抗 (HRP 标记的山羊抗鸡Ig Y) 、完全/不完全弗氏佐剂 (美国 Sigma) ;胎牛血清、Ni-NTA 亲和层析 (美国 Invitrogen) ;鸡抗 Hp Ig Y (Ig Y-Hp) 由本实验室制备;其他化学试剂均为分析纯;海兰白蛋鸡苗购自自贡市某鸡场。1.2 样本收集、培养及基因组 DNA 抽提胃黏膜样本取自富顺县人民医院胃
13、肠镜科, 患者胃炎史长达 3 年且 C-呼气试验阳性, 对本研究知情同意。活检钳于无菌条件下取出病灶组织 (1 mm1 mm5 mm) , 剪碎后涂板于哥伦比亚血琼脂培养基上 (含 7%胎牛血清及 1%抗生素添加剂) , 37微需氧条件下培养 (N 2:85%, O2:10%, CO2:5%, 湿度:50%RH) 。培养至 5 d 左右, 挑取与 Hp 相似的菌落做纯种培养。收集菌体, 取少量用于脲酶、氧化酶、触酶生化分析。另取部分菌体抽提基因组 DNA, 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测质量。1.3 Hpa A 重组蛋白的表达hpa A 扩增引物为 hpa A-F:5-CCGGAATTC (Eco
14、 R I) TGCAGCCCGCAT ATTA-3;hpa A-R:5-CCGCTCGAG (Xho) TTA TCGGTTTCTCTTG-3。取 10 ng 抽提的基因组 DNA 作为模板, 配制 50l PCR 体系, 另含前后引物各 20mol/L, 10 mmol/L Tris-HCl (p H=8.3) , 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L Mg, 1 mmol/L d NTPs 以及 0.1 U pfu 聚合酶。扩增条件为 95预变性 5 min;共 35 次循环;94变性 45 s, 58退火 50 s, 72延伸 2 min;循环结束后 72再次延伸 5 mi
15、n。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。回收 PCR 产物, 经 Eco R和Xho双酶切后与 p ET32a 双酶切产物 16过夜连接。将连接产物转入 E.coli TOP10 感受态细胞内, 涂板于 LA 固体培养基上 (含1Amp 的固体 LB 培养基) 。37过夜培养后, 挑取单菌落接种于 5 ml LA 液体培养基中, 37摇床培养 8 h。提取质粒并送由华大基因测序。将阳性重组质粒转入 E.coli BL21 (DE3) Plys S 感受态细胞中, 37平板培养过夜后挑取单菌落接种于 50 ml LA 液体培养基中。37200 r/min 摇床培养至OD600 nm值介于 0.
16、6 到 0.8 之间, 以终浓度 1 mmol/L 的 IPTG、26继续培养 6 h 诱导表达。收集菌体重悬于 15 ml 裂解缓冲液 (含溶菌酶 1 mg/ml) , 4酶解 1 h。超声 (100 W, 超声 6 s, 间隔 3 s, 共 5 min) 裂解菌体。收集上清和沉淀, SDS-PAGE 电泳分析。1.4 可溶性 Hpa A 重组蛋白的纯化及抗原性检测Ni-NTA 琼脂糖凝胶经 10 mmol/L 咪唑 (p H=8) 预先平衡后加入裂解上清中, 低温低速搅拌 2.5 h, 1 500 g 离心 2 min。20 mmol/L 咪唑 (p H=6) 洗涤沉淀, 重复 3 次。5
17、00 mmol/L 咪唑 (p H=8) 洗脱。PBS 透析除去产物中的咪唑, 12%SDS-PAGE 检测纯度。Western blotting 分析 Hpa A 重组蛋白的抗原性。具体而言, 将纯化后的 Hpa A 重组蛋白以半干转法转移至 NC 膜上, 5%BSA 溶液中室温封闭 3 h;PBST 洗涤 3次;Ig Y-Hp 溶液中 (11 000 稀释, 稀释液为 1%的 BSA 溶液) 4孵育过夜;PBST 洗涤, 二抗 (13 000 稀释) 室温孵育 1.5 h;PBST 洗涤, DAB 显色。PBST 洗涤控制在 5 min10 min/次。1.5 疫苗制备及免疫海兰白蛋鸡笼养
18、于清洁环境下, RO 反渗滤系统制备饮用水, 以全价饲料饲养。将 Hpa A 重组蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合, 超声法 (100 W, 超声 1 0 s, 停止 5 s, 共 1 min) 乳化。初次免疫剂量为每只 0.5 mg/ml, 胸部三点肌肉注射;间隔 1 周后加强免疫, 改用不完全弗氏佐剂, 免疫剂量下调至每只 0.3 mg/ml。对照组以 PBS 作为疫苗免疫。1.6 卵黄抗体提取及滴度检测加强免疫 1 周后, 连续 10 d 收集鸡蛋。分离蛋黄和蛋清, 向蛋黄中加入 7 倍体积的蒸馏水, 调 p H 至 5.0。4静置过夜, 10 000 r/min 离心 10 min。上清
19、中加入终浓度为 8.8%的 Na Cl, 调 p H 至 4.0。4静置 2 h, 再次离心。卵黄同等体积的 PBS 重悬沉淀, 透析除去盐分, 12%SDS-PAGE 电泳结合 Image J 1.48v 软件分析 Ig Y 纯度。0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液 (p H=9.5) 稀释 Hpa A 重组蛋白至 10g/ml, 并按100l/孔加入到酶标板中, 4过夜包被;PBST 洗涤后加入 200l 5%BSA 溶液, 37封闭 2 h;PBST 洗涤, 将 Ig Y 梯度稀释至 1150 000, 100l/孔, 37孵育 1.5 h;PBST 洗涤并按每孔 100l 加入二抗 (
20、130 000 稀释) , 37孵育 0.5 h;洗板后加入 100l TMB 单组分显色液避光显色 5 min;100l 的H2SO4 (1 mol/L) 终止反应, 读取 OD450 nm值。1.7 Dot blot取 1 ml Hp 菌液 (OD 600 nm=0.5) 离心, 等体积 0.5%甲醛溶液重悬, 4灭活 24 h。离心, 100l 无菌生理盐水重悬。在 NC 膜正面点样 4l, 自然干燥后, 浸泡入 5%BSA 溶液中 37孵育 2 h, PBST 洗涤 3 次。滴加 100l 预先稀释好的Ig Y 覆盖各点, 37孵育 1 h, PBST 洗涤 3 次。将 NC 膜转入二
21、抗溶液 (11 000 稀释) , 室温孵育 0.5 h, PBST 洗涤 4 次, DAB 显色。1.8 抑菌分析调节 Ig Y-Hpa A 原液 p H 至中性, 0.22m 滤膜过滤除菌, 以 20、10、5 mg/ml 终质量浓度加入 20 ml BHI 液体培养基中, 另加入 FBS (终浓度 7%) 、100l Hp 培养基添加剂及 500l Hp 菌液 (OD 600 nm=0.5) 。37微需氧振荡培养, 间隔 12 h 测定 OD600 nm值。另取 200l Hp 菌液离心, 500l 脲酶试剂重悬菌体, 加入终质量浓度分别为 1 mg/ml 和 10 mg/ml 的 Ig
22、 Y-Hpa A, 37孵育 0.5 h。1.9 统计学分析SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析, 组间差异显著性采用 Students t 检验评估, 各实验重复 3 次以上。P0.05 认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 幽门螺杆菌的培养疑似 Hp 分离株的菌落直径约为 1 mm2 mm, 呈现扁平、湿润及半透明状态 (图1a) 。对其进行生化分析发现, 脲酶、氧化酶、触酶生化鉴定均呈现阳性 (图1bd) , 与幽门螺杆菌特性相符。图 1 WT-Hp 的分离培养及生化鉴定 Fig 1 Isolation, culture and biochemical identificatio
23、n of wild-type Hp 下载原图a) Colonial morphology of isolate;b-d) biochemical assay for urease, catalase and oxidase identification, respectively.NC:Negative controls;Isolate:Putative wild-type Hp isolate.2.2 基因组 DNA 的提取及 hpa A 基因的 PCR 扩增电泳结果显示 (图 2a) , 抽提的基因组 DNA 条带完整。以此作为模板进行 PCR扩增出一条 702 bp 的特异性条带 (图
24、2a) 。测序结果经 BLAST 比对发现与 hpa A 基因序列 (AY714223.1) 相似度高达 96.72%, 蛋白质序列相似性高达97.85%。2.3 Hpa A 重组蛋白的表达及纯化SDS-PAGE 结果显示, IPTG 诱导前后样品条带在 Mr45 000 处有明显的丰度差异, 裂解后主要存在于上清中 (图 2b) 。DAB 显色后, NC 膜上 Mr45 000 位置附近有一特异性条带 (图 2c) , 表明以 Hp 全菌制备的 Ig Y 抗体可特异性识别并结合Hpa A 重组蛋白。图 2 Hpa A 重组蛋白的制备 Fig 2 Preparation of Hpa A re
25、combinant protein 下载原图a) Amplification of Hpa A from isolate:M) DNA marker DL5000;1) genomic DNA extracted from clinical isolate;2) PCR result of Hpa Afrom isolate.b) SDS-PAGE analysis of recombinant Hpa A protein:M) SM1881 marker;1) p ET32a-Hpa A transformants without IPTGinduction;2) p ET32a-Hpa A
26、 transformants with 1 mmpl/L IPTGinduction at 26;3) precipitation of p ET32a-Hpa A transformants induced by IPTG;4) supernatant of p ET32a-Hpa A transformants induced by IPTG induction.c) Western blotting result of Hpa Arecombinant protein:M) SM1881 marker;1) Hpa A recombinant protein.2.4 卵黄抗体纯化及滴度检
27、测非还原条件下, Ig Y 相对分子质量大于 250 000, 经变性处理后裂解成重链 (H-链, 约 Mr70 000) 和轻链 (L-链, M r25 000) (图 3a) 。光密度扫描 Ig Y纯度达 95%, 每毫升卵黄中 Ig Y-Hpa A 的产量约 12.45 mg。ELISA 分析结果显示 (图 3b) , 随着一抗稀释比例的增大, OD 450 nm值不断降低。当稀释至1150 000 时, Ig Y-Hpa A 组仍具有较高的 OD450 nm值, 但 Ig Y-PBS 组几乎检测不到信号。2.5 抑菌分析Ig Y-Hpa A 稀释至 11 000 时, 仍能检测到与 H
28、p 菌体的明显结合, 而 Ig Y-PBS 对 Hp 无识别能力 (图 4a) 。向脲酶反应体系中分别加入低质量浓度 (1 mg/ml) 和高质量浓度 (10 mg/ml) 的 Ig Y-Hpa A, 体系颜色不发生变化, 仍呈玫红色 (图 4b) 。但低剂量的 Ig Y-Hpa A (5 mg/ml) 即可对 Hp 的体外生长产生较显著的抑制作用, 随着剂量的增加 (10 mg/ml) , Hp 生长的抑制越来越显著。特别地, 当升至 20 mg/ml 条件下培养时, 此时 Hp 生长被完全抑制 (图4c) 。图 3 Ig Y-Hpa A 纯化及滴度检测 Fig 3 Purification
29、 and titer analysis of Ig Y-Hpa A 下载原图a) Purity analysis of Ig Y-Hpa A by SDS-PAGE:M) SM1881marker;1) purified Ig Y-Hpa A in non-reducing condition;2) purified Ig Y-Hpa A in reducing condition.b) Titer analysis of Ig Y-Hpa A.图 4 Dot blotting 与抑菌分析 Fig 4 Dot blot analysis and antibacterial activities
30、 of Ig Y-Hpa A 下载原图a) Dot blot analysis of Ig Y-Hpa A.b) Effects of Ig Y-Hpa A on the urease of Hp:1) negative control;2) positive control;3) Ig Y-Hpa A at1 mg/ml;4) Ig Y-Hpa A at 10 mg/ml.c) Inhibitory effect of Ig Y-Hpa A to the growth of Hp.3 讨论幽门螺杆菌是引起多种胃部不适的直接病原性因子, 严重影响了人类的健康水平和生命安全。目前治疗幽门螺杆菌的
31、方案虽然较为有效, 但存在二次感染、菌株耐药性、副作用大等严重问题。而以全菌疫苗免疫制备的 Ig Y-Hp 抗体虽然对幽门螺杆菌的生长和脲酶活性有一定的抑制作用14, 但在研究过程中我们发现, 以全菌疫苗免疫鸡蛋中高效价抗体持续时间仅 2 周左右, 且存在返毒和散毒风险, 不具有开发的商业性。近年来, 随着基因重组等分子生物学技术的发展, 更多的研究选择以亚单位疫苗的形式制备特异性更高、持续时间更长的卵黄抗体, 并且在抑制 Hp 的黏附及体内定植方面展现出了良好的效果15-16。本研究从脲酶阳性的胃炎患者胃部病灶中分离 1 株野生型 Hp, 通过体外重组获得了可溶形式表达且具有良好抗原性的 H
32、pa A 重组蛋白, 经 Blast 比对抗原区域与标准株 Hpa A 氨基酸序列相似性为 97.85%。由于其 N 端连有便于纯化的Trx-tag、His-tag 以及 S-tag 标签, 因而得到的重组蛋白相对分子质量略大于其实际相对分子质量 (约 Mr30 000) , 但与文献描述的相近17。而制备的 Ig Y-Hpa A 经 11 000 稀释后仍具有识别 Hp 的能力, 表明制备的 Hpa A 重组蛋白可良好地呈现 Hpa A 蛋白分子的抗原决定簇, 更加贴合抗原的天然活性。以水稀释法萃取卵黄中的水溶性成分, 结合氯化钠盐析, 获得的 Ig Y 纯度和产率均可达到较高水平。进一步分
33、析表明, Ig Y-Hpa A 虽对 Hp 的脲酶活性并未产生影响, 但中等剂量即可显著地抑制 Hp 的体外生长。据此, 我们推测 Ig Y-Hpa A 可特异性封闭 Hpa A 结合位点, 破坏了 Hp 的空间构象, 进而抑制 Hp 的黏附及生长, 但具体机制仍需进一步分析。本研究为进一步探讨 Ig Y-Hpa A 对幽门螺杆菌的体内黏附清除机制提供了重要的参考, 也为克服全菌疫苗的不足及抗体生产的可持续性奠定了基础。参考文献1Chmiela M, Miszczyk E, Rudnicka K.Structural modifications of Helicobacter pylori l
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