1、脊髓缺血药物药效试验观察 脊髓缺血疾病是临床上常见疾病，世界各国都对其损伤的分子学机制及治疗手段进行了深入的研究。近年来兴奋性神经毒性学说越来越引起国内外学者们的重视。谷氨酸是一种重要的兴奋性神经递质，生理状态下在神经发育、突触可塑性的维持、神经元回路的形成及学习过程发挥重要作用1。本课题前期研究发现谷氨酸等兴奋性氨基酸通过其重要受体，即N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)与诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)共同介导了脊髓
2、缺血细胞凋亡通路，导致神经元损伤2。MK-801，又名地佐环平，是一种兴奋性氨基酸受体拮抗剂，近年来大量研究发现其对多种组织损伤具有保护作用，但对脊髓缺血性损伤的保护作用研究较少。本文将研究MK-801对脊髓缺血性损伤的保护机制，以探索它对脊髓损伤的保护作用。 1材料和方法 11材料及试剂 MK-801购自厦门泰京生物技术有限公司，NMDAR、Caspase-3PCR引物由上海鼎安生物技术公司合成，iNOSPCR引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，TrizolReagent购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自东洋纺(上海)生物技术有限公司，即用型PCR反应体系购自Fermenta
3、s公司，羊抗兔NMDAR多克隆抗体购自Lifespan公司，羊抗兔Caspase-3多克隆抗体与羊抗兔iNOS多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL染色试剂盒购自德国默克公司。 12实验动物及脊髓缺血模型建立3 新西兰大白兔32只雄性，体重225kg。耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30mg/Kg)，麻醉成功后，取24只结扎其左肾动脉以下5根腰动脉，建立脊髓缺血模型。随机分为对照组、低剂量组、高剂量组，立即分别腹腔注射等量生理盐水、1mg/(kgd)MK-801和2mg/(kgd)MK-801，另取8只设立假手术组，只分离腰动脉但不结扎，给予等量生理盐水，术后24小时及48小时再按上
4、述剂量各注射1次，72小时后过度麻醉动物，生理盐水心脏灌注后迅速取L3-L5节段的脊髓组织，横断面切断脊髓组织(包括前角和后角)，每块100mg左右，以备以下实验应用。 13HE染色观察脊髓前角形态 将脊髓组织迅速置于4%多聚甲醛固定24小时，再将固定后的组织常规脱水、石蜡包埋，制作连续切片。片厚4m，常规HE染色，观察脊髓前角形态学变化。 14免疫组织化学方法测定 脊髓组织中NMDAR、iNOS、Caspase-3蛋白的表达部位将脊髓组织迅速置于4%多聚甲醛固定24小时，再将固定后的组织常规脱水、石蜡包埋，制作连续切片。实验步骤按说明书进行，DAB显色，于光学显微镜下观察NMDAR、iNOS
5、、Caspase-3蛋白在脊髓前角细胞的表达定位情况。 15细胞凋亡检测 将脊髓组织迅速置于4%多聚甲醛固定24小时，再将固定后的组织常规脱水、石蜡包埋，连续切片。利用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)，实验步骤按说明书进行，进行细胞凋亡检测，DAB显色。于光学显微镜下观察脊髓前角细胞凋亡变化。 16逆转录反应系统(RT-PCR)测定脊髓组织中 NMDAR、iNOS、Caspase-3mRAN的含量将脊髓组织迅速置于液氮罐中备用，Trizol提取总mRNA，分光光度计测定mRNA浓度及A260/A280，取总mRNA05g进行逆转录，再以逆转录产物1l作为模板加入相应引物(-actin作为内
6、参照)进行PCR扩增，反应体系25l。所用引物序列如下:-actin(5-AAGAATAACTAGAGAAGAAGCAG-3，5-CTTGTGGAGAAGCTTGTAATG-3);iNOS(5-AGTACTTTGGCAATGGAGACT-3，5-CAGGTCACATTG-GAGGTGTAGA-3);NMDAR(5-TGCAAGTGGGCATC-TACAATGG-3，5-TTGTTGCTGTTGTTTACCCGC-3);Caspase-3(5-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3，5-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3)4。扩增条件:95预变性10min，95变性(NMDAR:
7、30s;iNOS:30s;NCaspase-3:45s)，退火(NMDAR:56，30s;iN-OS:55，30s;Caspase-3:56，30s)，72延伸(NMDAR:30s;iNOS:30s;Caspase-3:60s)(以上步骤循环37次)，最后72继续再延伸7min。PCR产物用15%琼脂糖凝胶(内含核酸燃料Gold-view)电泳，美国伯乐BIO-RADGelDocTMXR凝胶成像系统观察和照相，独立重复3次实验，以-ac-tin作为内参照，与同步产物进行比较，对PCR产物相对定量，用quantityone分析软件半定量分析，计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密度的比值来
8、反映该基因mRNA的水平。 17统计学分析 实验数据处理结果以(xs)表示，统计学处理采用SPSS130统计软件进行方差分析及组间比较，P005为有差异，具有统计学意义。 2结果 21HE染色结果 对照组脊髓正常结构基本消失，显示脊髓广泛充血肿胀，可见大量的空泡变性，正常神经元极少，大多数神经元细胞核萎缩或溶解，胞质成嗜伊红染色，胞质中尼氏体消失。低剂量组结构较对照组完整，正常神经原数量较多，神经元变性坏死现象较对照组减轻。假手术组可见正常脊髓结构，神经元形态正常。高剂量组缺血损伤情况介于低剂量组与假手术组之间。(见图1) 22脊髓组织NMDAR、iNOS、Caspase-3蛋白的细胞定位 免
9、疫组织化学显示NMDAR、iNOS、Caspase-3阳性细胞呈棕黄色，它们主要表达在细胞浆中，细胞核内也可见少量表达。(见图2) 23TUNEL检测结果 光镜下观察脊髓前角细胞TUNEL染色，随机计算5个高倍视野下凋亡细胞数占细胞总数的百分比得出细胞凋亡指数。可见对照组大部分细胞发生萎缩、溶解、核固缩，细胞浆出现深染等细胞凋亡的特征，计算凋亡指数为(75479)%。低剂量组有较多凋亡细胞(53465)%，凋亡指数低于对照组。高剂量组为(43461)%，较低剂量组凋亡指明显降低。假手术组细胞保持完好，只见极少量凋亡细胞(36810)%。方差分析及组间比较均有统计学差异(F=939，P005)(
10、见图3) 24脊髓组织NMDAR、iNOS、Caspase-3mRNA的表达 各组脊髓标本提取总RNA，分光光度计测定各样本A260/A280均在1820之间，说明抽提RNA质量可，可进行后续实验。NMDAR、iNOS、Caspase-3mRNA的片段大小分别为400bp、341bp、294bp，相对含量在对照组最高，低剂量组、高剂量组、假手术组其相对含量有逐渐降低的趋势，各组NMDARmRNA相对含量经方差分析及各组间比较均有统计学差异(F=12259，P005)，各组iNOSmRNA相对含量经方差分析及各组间比较均有统计学差异(F=10144，P005)，各组Caspase-3mRNA相对
11、含量经方差分析及各组间比较均有统计学差异。(F=9018，P005)(见表1、图4)。 3讨论 MK-801，是一种中枢神经系统保护类药物可以非竞争性特异性拮抗NMDAR，减少谷氨酸的毒性，大量研究证实其对多种原因造成的神经元损伤具有保护作用5-7。脊髓缺血引起的神经元损伤在临床上较常见，近年来许多学者对脊髓缺血性损伤的机制做了大量研究。1964年Olney首先提出兴奋性神经毒性一词，认为谷氨酸等兴奋性神经递质的大量释放可能会导致神经元的损伤，Megumu等8学者运用电生理学方法也首次证实脊髓组织中存在NMDAR。Liu等9学者证实大量释放的谷氨酸的递质可介导神经元凋亡，导致脊髓继发性损伤。在
12、外伤等各种原因引起的脊髓缺血性疾病使脊髓组织兴奋性氨基酸大量释放作用于NMDAR，过度激活NMDAR，引起细胞内Ca2+超载，从而引起一系列Ca2+依赖的分子学变化，造成神经元损伤。Pradeep等10研究发现当神经元细胞缺血时，谷氨酸大量释放，NMDAR敏感性增加，介导Ca2+大量内流，激活iNOS等神经细胞损伤的关键酶，产生大量氧自由基，导致大量神经细胞损伤。本课题组在前期研究中证实激活的iNOS催化底物后生成NO，后者激活蛋白激酶，使蛋白质磷酸化，磷酸化蛋白质能够激活Caspase-3的活性，而Caspase-3属于半胱天冬蛋白酶家族，是已知的该家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，活化的
13、Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，介导缺血缺氧后期迟发性的神经毒性作用，最终使细胞走向凋亡，并且证实NMDAR与Caspase-3存在上下游关系2，4，11。 本研究证实MK-801能稳定细胞结构，保持脊髓结构的完整性。利用免疫组化检测，明确定位NMDAR、iNOS、Caspase-3等蛋白的表达部位，主要表达于细胞浆中，细胞核中较少，这说明NMDAR、iNOS、Caspase-3在神经元中有明确表达，这与国内外研究结果一致。TUNEL凋亡检测也发现MK-801可抑制细胞凋亡，低剂量组凋亡指数低于对照组，高剂量组较低剂量组凋亡指数明显降低，假手术组细胞保持完好，
14、只见极少量凋亡细胞。RT-PCR检测NMDAR、iNOS、Caspase-3等基因在对照组表达最高，经MK-801治疗后基因表达水平降低，且加大剂量后降低更为明显。本研究结果支持MK-801能竞争性抑制谷氨酸等兴奋性神经递质与NMDAR结合，降低NMDAR的敏感性，阻断NMDAR介导的Ca2+内流，减少Ca2+在神经元内的蓄积，抑制Ca2+对iNOS等神经细胞损伤关键酶的激活，阻断iNOS对蛋白激酶的激活及蛋白质磷酸化，从而减弱Caspase-3的活性，使活化的Caspase-3导致的蛋白酶级联切割放大作用减弱，阻断细胞走向凋亡，从而发挥对脊髓缺血的神经保护作用。本实验结果与本课题组的前期研究及国内外其他学者的研究结果相一致，希望能为脊髓缺血的临床治疗提供一定的帮助。第 7 页 共 7 页
