1、无无 公公 害害 食食 品品 生生 产产 检检 测测 与与 管管 理理 规规 范范 实实 务务 全全 书书 无公害食品卫生标准 (二) 卢炳瑞 主编 中国言实出版社 图 书 在 版 编 目 (CIP)数 据无 公 害 食 品 生 产 检 测 与 管 理 规 范 实 务 全 书 /卢 炳 瑞 主 编 北 京 :中 国 言 实 出 版 社 2004.9ISBN 7-80128-319-4无 卢绿色食品 食品加工 汇编 TS207.2中国版本图书馆 CIP 数据核字(2004)第 103279 号中国言实出版社出版发行(北 京 市 西 城 区 府 右 街 2 号 邮政编码 100017) 中铁十六局
2、印刷厂787 1092 32 418.75 印张2004 年 9 月第 1 版 2004 年 9 月第 1 次印刷印 数 :1 1 000 册 定价 :3200.00 元 (本 卷 16.00 元 )I目 录 牛结核病防治技术规范 .1我国推出水果农残新标准 .10小麦中 T-2 毒 素 的 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 方 法 (ELISA)10精制绵白糖 .21磷酸二氢钙 .30瘤胃微生物脲酶抑制剂质量标准 .41饲料级 DL-蛋 氨 酸 .46规模化养猪场生产技术规范 .58淀粉分类 .79粉类制品卫淀生标准的分析方法 .86绵白糖国家标准 .88绵.山羊产肉性能评估的技术指标 92黑
3、白花奶牛国家标准 .93小麦特二粉质量标准 .93林木种质资源保存原则与方法 .94食品卫生微生物学检验 清凉饮料检验 100食品卫生微生物学检验 调味品检验 103食品卫生微生物学检验 酒类检验 106食品卫生微生物学检验 蛋与蛋制品检验 108食品卫生微生物学检验 肉与肉制品检验 .113I食品卫生微生物学检验 乳与乳制品检验 .117木糖醇 .121氯化氨 .123高致病性禽流感 疫情判定及扑灭技术规范 125蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法 酶抑制法 132禽肉无公害生产技术规程 .138农作物种子检验规程-真实性和品种纯度鉴定 .151原产地域产品 盘锦大米 164粮
4、食.油料检验米类加工精度检验法 171食用绿豆 .172糙米 .178米大麦 .181稷米 .185黍米 .188食用粳米 .191粟 谷 子 202淀粉业用甘薯片 .206无公害食品卫生标准 1牛结核病防治技术规范牛 结 核 病 Bovine Tuberculosis 主要是由牛 型结核分枝杆菌 Mycobacterium bovis 引起的一 种 人 畜 共 患 的 慢 性 传 染 病世 界 动 物 卫 生 组 织 OIE 将其列为 B 类动物疫病 我国将其列为二类动物疫病 为 了 预 防 .控 制 和 净 化 牛 结 核 病 根 据 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法 及 有
5、 关 的 法 律 法 规 特 制 定 本规范 1 适用范围 本 规 范 规 定 了 牛 结 核 病 的 诊 断 .疫 情 报 告 .疫 情处理.防治措施.控制和净化标准 本 规 范 适 用 于 中 华 人 民 共 和 国 境 内 一 切 从 事 牛的 饲 养 .经 营 和 牛 产 品 的 生 产 .经 营 以 及 从 事 动 物 防疫活动的单位和个人 2 诊断 本 病 依 据 流 行 病 学 .临 床 症 状 .病 理 变 化 可 做 出初 步 诊 断 确 诊 需 进 一 步 做 病 原 分 离 鉴 定 或 免 疫 学 诊断 2.1 流行特点 无公害食品卫生标准 2本 病 奶 牛 最 易 感
6、其 次 为 水 牛 .黄 牛 .牦 牛 人 也 可 感 染 结 核 病 病 牛 是 本 病 的 主 要 传 染 源 牛 型无公害食品卫生标准 3结 核 分 枝 杆 菌 随 鼻 汁 . 痰 液 . 粪 便 和 乳 汁 等 排 出 体 外 健 康 牛 可 通 过 被 污 染 的 空 气 .饲 料 .饮 水 等 经 呼 吸道.消化道等途径感染 2.2 临床症状 潜伏期一般为 10 45 天 有的可长达数月或数 年 通常呈慢性经过 临 床 以 肺 结 核 .乳 房 结 核 和 肠 结核最为常见 肺 结 核 以 长 期 顽 固 性 干 咳 为 特 征 且 以 清 晨 最 为 明 显 患 畜 容 易 疲
7、劳 逐 渐 消 瘦 病 情 严 重 者 可见呼吸困难 乳 房 结 核 一 般 先 是 乳 房 淋 巴 结 肿 大 继 而 后 方 乳 腺 区 发 生 局 限 性 或 弥 漫 性 硬 结 硬 结 无 热 无 痛 表 面 凹 凸 不 平 泌 乳 量 下 降 乳 汁 变 稀 严 重 时乳腺萎缩 泌乳停止 肠结核 消 瘦 ,持 续 下 痢 与 便 秘 交 替 出 现 粪便 常带血或脓汁 2.3 病理变化 在 肺 脏 .乳 房 和 胃 肠 粘 膜 等 处 形 成 特 异 性 白 色 或黄 白 色 结 节 结 节 大 小 不 一 切 面 干 酪 样 坏 死 或 钙 化 有 时 坏 死 组 织 溶 解 和
8、软 化 排 出 后 形 成 空 洞 胸膜和肺膜可发生密集的结核结节 形如珍珠状 无公害食品卫生标准 42.4 实验室诊断 2.4.1 病原分离鉴定 采 集 病 牛 的 病 灶 .痰 .尿 .粪 便 .乳 及 其 它 分 泌 物样 品 作 抹 片 或 集 菌 处 理 后 抹 片 用 抗 酸 染 色 法 染 色镜检 并进行病原分离培养和动物接种等试验 2.4.2 免疫学试验 牛型结核分枝杆菌 PPD 提纯蛋白衍生物 皮内 变 态 反 应 试 验 即 牛 提 纯 结 核 菌 素 皮 内 变 态 反 应 试 验 见 GB/T18646 2.5 结果判定 凡 分 离 出 牛 型 结 核 分 枝 杆 菌
9、或 牛 型 结 核 分 枝 杆菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 阳 性 的 牛 均 判 为 结 核 病 牛 3 疫情报告 3.1 任 何 单 位 和 个 人 发 现 患 有 本 病 或 者 疑 似 本 病 的 动 物 都 应 当 及 时 向 当 地 动 物 防 疫 监 督 机 构 报 告 3.2 动 物 防 疫 监 督 机 构 接 到 疫 情 报 告 后 立 即 按 动 物 疫 情 报 告 管 理 办 法 及 有 关 规 定 及 时 上 报 无公害食品卫生标准 54 疫情处理 4.1 发 现 疑 似 结 核 病 病 畜 后 畜 主 应 立 即 将 其无公害食品卫生标准 6隔 离 并
10、限 制 其 移 动 当 地 动 物 防 疫 监 督 机 构 要 及 时 派 员 到 现 场 进 行 流 行 病 学 调 查 .临 床 症 状 检 查 .病 理 解 剖 .病 料 采 集 .实 验 室 诊 断 等 工 作 根 据 诊 断 结 果采取相应措施 4.2 确 诊 牛 结 核 病 患 畜 后 必 须 按 下 列 要 求 处 理 4.2.1 扑杀病牛和阳性牛 4.2.2 划定疫点.疫区.受威胁区 疫 点 指 病 畜 所 在 的 栋 舍 .户 或 其 它 有 关 屠 宰 场 点 .经营单位 疫 区 指 病 畜 所 在 的 饲 养 场 . 自 然 村 的 范 围 区 域 在 疫 区 划 分 时
11、 注 意 考 虑 当 地 的 饲 养 环 境 和 天 然 屏障 如河流.山脉等 受 威 胁 区 指 与 疫 区 相 毗 邻 的 饲 养 场 .自 然 村 的 范围区域 4.2.3 隔离.封锁 零星散发时 可 采 用 圈 养 和 固 定 草 场 放 牧 方 式 , 对 病 畜 的 同 群 畜 实 施 隔 离 隔 离 所 用 草 场 应 远 离 交 通 要 道 .居 民 点 或 人 畜 密 集 的 地 区 场 地 周 围 最 好 有自然屏障或人工栅栏 当一个自然村.饲养场结核病阳性率在 3%以上或 病牛 10 头以上时 应对疫区实施封锁 禁止病牛和无公害食品卫生标准 7疑 似 病 牛 .易 感 动
12、 物 及 其 产 品 调 出 ;对 易 感 动 物 实 行 圈 养 或 指 定 地 点 饲 养 役 用 动 物 限 制 在 疫 区 内 使 役 4.2.4 无害化处理 病死和扑杀的病畜 要 按 照 GB16548-1996 畜 禽 病 害 肉 尸 及 其 产 品 无 害 化 处 理 规 程 进 行 无 害 化 处理 4.2.5 紧急监测 用牛型结核分枝杆菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 对 疫区和受威胁区的全部牛进行紧急监测 4.2.6 消毒 对 病 畜 和 阳 性 畜 污 染 的 场 所 .用具 .物 品 进 行 严格消毒 饲 养 场 的 金 属 设 施 .设 备 可 采 取 火
13、焰 .熏 蒸 等 方 式消毒 养 畜 场 的 圈 舍 .场 地 .车 辆 等 可选用 2%烧 碱等有效消毒药消毒 饲 养 场 的 饲 料 .垫 料 可 采 取 深 埋 发 酵 处 理 或 焚 烧 处 理 粪 便 采 取 堆 积 密 封 发 酵 方 式 以及其它相应的有效消毒方式 4.2.7 封锁的解除 封 锁 的 疫 区 内 最 后 一 头 病 畜 及 阳 性 畜 被 扑 杀经无害化处理后 对疫区内监测 45 天以上 没有发 无公害食品卫生标准 8现新病例 对 所 污 染 场 所 .设 施 设 备 和 受 污 染 的 其 它无公害食品卫生标准 9物 品 进 行 彻 底 消 毒 经 当 地 动
14、物 防 疫 监 督 机 构 检 验 合格后 由原发布封锁令的机关解除封锁 5 预防与控制 采 取 以 监 测 .检 疫 .扑 杀 和 消 毒 相 结 合 的 综 合性防治措施 5.1 监测 监测对象 牛 监 测 比 例 为 种 牛 . 奶 牛 100% 规 模 场 肉 牛 10% 其它牛 5% 疑似病牛 100% 如 在 牛 结 核 病 净 化 群 中 包 括 犊 牛 群 检 出 阳 性 牛 时 应 及 时 扑 杀 阳性牛 其它牛按假定健康群处理 成 年 牛 净 化 群 每 年 春 秋 两 季 用 牛 型 结 核 分 枝 杆 菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 各 进 行 一 次 监
15、测 初生犊 牛 应于 20 日龄时进行第一次监测 所 有 的 种 牛 .奶 牛 每 年 必 须 进 行 两 次 监 测 并按 规定使用和填写监测结果报告 及时上报 5.2 种牛.奶牛调运的检疫 异地引进的种牛.奶牛 必须来自于非疫区 调出前 在装运前 30 天内 须经当地动物防疫监 督 机 构 实 施 检 疫 检 疫 合 格 并 出 具 有 效 检 疫 证 明后 方可起运 无公害食品卫生标准 10调 入 的 种 牛 .奶 牛 必 须 隔 离 观 察 45 天以上无公害食品卫生标准 11且经牛型结核分枝杆菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 检 查 阴性者 方可混群饲养 5.3 工作人员
16、牛 场 工 作 人 员 每 年 要 定 期 进 行 健 康 检 查 发 现 有 患 结 核 病 的 应 及 时 调 离 岗 位 隔 离 治 疗 工 作 人员的工作服.用具要保持清洁 不得带出牛场 5.4 饲养环境 牛 饲 养 场 生 产 区 应 与 生 活 区 隔 离奶 牛 场 内 不应 饲 养 猫 .狗 .猪 .鸡 .鸭 等 动 物 并 应 禁 止 其 它 动 物 出入 消灭鼠.蝇等传播媒介 5.5 防疫监督 动 物 防 疫 监 督 机 构 要 对 辖 区 内 奶 牛 场 .种 牛 场 登记 造 册 并 建 立 档 案 布 病 结 核 病 监 测 合 格 是 奶 牛 场 .种 牛 场 动 物
17、 防 疫 合 格 证 发 放 或 年 度 审 验 的 必 备条件 鲜 奶 收 购 点 站 必 须 凭 动 物 防 疫 合 格 证 对奶牛场 户 收购鲜奶 5.6 净化措施 被 确 诊 为 结 核 病 牛 的 牛 群 场为 牛 结 核 病 污无公害食品卫生标准 12染群 场 应全部实施牛结核病净化 5.6.1 牛结核病净化群 场 的建立 5.6.1.1 污 染 牛 群 的 处 理 应 用 牛 型 结 核 分 枝无公害食品卫生标准 13杆 菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 对 该 牛 群 进 行 反 复 监 测 每次间隔 3 个月 发 现 阳 性 牛 及 时 扑 杀 并按 照 4 规定处
18、理 5.6.1.2 假 定 健 康 牛 群 的 处 理 经 扑 杀 病 牛 及 阳 性 牛 后 的 牛 群 为 假 定 健 康 牛 群 用 牛 型 结 核 分 枝 杆菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 进 行 反 复 监 测 每次监 测间隔 90 天 发现阳性牛及时扑杀 犊牛应于 20 日龄时进行第一次监测 100 120 日 龄 时 进 行 第 二 次 监 测 凡 连 续 两 次 以 上 监 测 结 果均为阴性者 可认为是牛结核病净化群 凡牛型结核分枝杆菌 PPD 皮 内 变 态 反 应 试 验 疑 似反应者 于 30 45 日后进行复检 复检结果为阳性 则 按 阳 性 牛 处 理
19、; 若 仍 呈 疑 似 反 应 则 间 隔 30 45 天再复检一次 结果仍为可疑反应者 视同阳性 牛处理 5.6.2 隔离 疑 似 结 核 病 牛 或 牛 型 结 核 分 枝 杆 菌 PPD 皮内变态 反 应 试 验 可 疑 畜 须 隔 离 复 检 隔 离 牛 舍 处 在 下 风 口 并与健康牛舍相隔 50 米以上 5.6.3 消毒 5.6.3.1 临 时 消 毒 奶 牛 群 中 检 出 并 剔 出 结 核 病牛后 牛舍.用具及运动场所等按照 4.2.6 规定进无公害食品卫生标准 14行紧急处理 5.6.3.2 定期消毒 养牛场每年应进行 2 4 次 大消毒 消毒方法同临时消毒 5.6.3.
20、3 经常性消毒 饲养场及牛舍出入口处 应设置消毒池 内置有效消毒剂 如 3 5%来苏尔溶 液或 20%石灰乳等 消毒药要定期更换 以保证一定 的药效 牛 舍 内 的 一 切 用 具 应 定 期 消 毒 ;产 房 每 周 进 行 一 次 大 消 毒 分 娩 室 在 临 产 牛 生 产 前 及 分 娩 后 各 进行一次消毒 6 控制.净化标准 6.1 县 市.区 净化标准 县 市.区 净化标准必须具备以下三个条件 6.1.1 全 县 市 .区 范 围 内 连 续 两 年 按 种 牛 .奶牛 100%.规模场的肉牛 10%.其它牛 5%的比例进行 监测 每 年 牛 型 结 核 分 枝 杆 菌 PPD
21、 皮 内 变 态 反 应 试 验阳性率在 0.05%以下 6.1.2 检 出 的 结 核 阳 性 牛 全 部 就 地 扑 杀 并 作 无害化处理 6.2 市 地.盟 净化标准 全 市 地 . 盟 所 有 县 市 . 区 达 到 净 化 标准 6.3 省 区.市 净化标准 无公害食品卫生标准 15全 省 区 . 市 所 有 县 市 . 区 达 到 净 化 标 准 6.4 全国净化标准 全国所有省 区.市 均达到净化标准 我国推出水果农残新标准目前,我国已制定了 79 种农药在 32 种(类)农副 产 品 中 农 药 最 高 残 留 限 量 的 国 家 标 准 其 中 有 关 水 果 农 药 残
22、留 最 高 限 量 的 新 标 准 ,每 公 斤 应 少 于 或 等 于 毫 克 数 为 :百 菌 清 1,倍 硫 磷 0.05,苯 丁 锡 5,草甘膦 0.1,除虫脲 1,代森锰锌 3(梨果),滴滴涕 0.1,敌百虫0.1,毒死蜱 1 ,对 硫 磷 不 得 检 出 ,多 菌 灵 0.5,二嗪磷0.5,氟氰戊菊酯 0.5,甲 拌 磷 不 得 检 出 ,甲 萘 威 2.5, 甲霜灵 1(小粒水果),抗蚜威 2.5,克菌丹 15,六六六 0.1,氟氯氰菊酯 0.2,氯菊酯 2,氰戊菊酯 0.2,炔螨特5(梨果),噻螨酮 0.5(梨果),三唑酮 0.2,三唑锡 2(梨果),杀螟硫磷 0.5,双甲脒
23、0.5(梨果),四螨嗪 1,辛硫 磷 0.05,溴氰菊酯 0.1(皮可食),亚胺硫磷 0.5,乙酰 甲胺磷 0.5,异 菌 脲 (梨 果 )10,敌 敌 畏 0.2,马 拉 硫 磷 不得检出 小麦中 T-2 毒素的酶联免疫吸附测定方法(ELISA)无公害食品卫生标准 161 主题内容与适用范围 无公害食品卫生标准 17本标准规定了谷物中 T 2 毒素的酶联免疫吸附 测定方法(ELISA) 本 标 准 适 用 于 小 麦 及 其 制 品 中 T 2 毒 素 的 测 定 本方法的最低检出量为 1 g/kg第一篇 间接法 2 原理 将 已 知 抗 原 吸 附 在 固 相 载 体 表 面 洗 除 未
24、吸 附 抗 原 加 入 一 定 量 抗 体 与 待 测 样 品 (含 有 抗 原 )提 取 液 的 混 合 液 竞 争 温 育 后 在 固 相 载 体 表 面 形 成 抗 原 抗 体 复 合 物 洗 除 多 余 抗 体 成 分 然 后 加 入 酶 标 记 的 抗 球 蛋 白 的 第 二 抗 体 结 合 物 与 吸 附 在 固 体 表 面 的 抗 原 抗 体 复 合 物 相 结 合 再 加 入 酶 的 底 物 在 酶 的 催 化 作 用 下 底 物 发 生 降 解 反 应 产 生 有 色 产 物 通 过 酶 标 检 测 仪 测 出 酶 底 物 的 降 解 量 从而推知被测样品中的抗原量 3 试剂
25、 本 标 准 所 用 试 剂 凡 未 指 明 规 格 者 均 为 分 析 纯 水为蒸馏水或用等纯度的水 3.1 甲醇 3.2 石油醚 3.3 三氯甲烷 无公害食品卫生标准 183.4 无水乙醇 3.5 乙酸乙酯 3.6 二甲基甲酸胺 3.7 四甲基联苯胺(TMB) 3.8 吐温 20 3.9 30%过氧化氢(30%H2O2) 3.10 抗体 杂交瘤细胞系 1D7 产生的抗 T 2 毒素的特异性单克隆抗体 3.11 抗原 T 2 毒 素 与 载 体 蛋 白 牛血清白 蛋白(BSA)的结合物 3.12 兔 抗 鼠 免 疫 球 蛋 白 与 辣 根 过 氧 化 酶 的 结 合物(酶标二抗) 3.13
26、ELISA 缓冲液系统 3.13.1 包 被 缓 冲 液 为 pH9.6 的 碳 酸 盐 缓 冲 液 称取 1.59g 碳酸钠 Na2CO3) 2.93g 碳酸氢钠 (NaHCO3) 加水稀释至 1000mL 3.13.2 洗液为含 0.05%吐温 20 的 pH7.4 的 磷酸盐缓冲液(简称为 PBS T)配制方法为 称 取 磷 酸 二 氢 钾 (KH2PO4)0.2g 磷 酸 氢 二 钠 (Na2HPO4 12H2O)2.9g 氯 化 钠 (NaCl)8.0g 氯 化 钾(KCl)0.2g 吐温 20 0.5mL 加水至 1000mL 3.13.3 底 物 缓 冲 液 为 pH5.0 的磷
27、酸 柠檬酸无公害食品卫生标准 19缓冲液 配制方法为 0.1mol/L 柠檬酸(C6H8O7 H2O) 即称取柠檬酸19.2g 加水至 1000mL 为甲液 0.2mol/L 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 即称取磷酸氢 二钠 71.7g 加水至 1000mL 为乙液 取甲液 24.3mL 乙液 25.7mL 加水至 100mL 即可 3.13.4 底物溶液 取 50 L TMB(10mg TMB 溶 于 1mL 二甲基甲酸胺中)溶液10mL 底物缓冲液 10L30%过氧化氢 混均 3.14 T-2 毒素标准溶液 用甲醇配成 1 mg/mL T 2 毒 素 贮 备 液 20冰箱贮存 于检测当天
28、精密吸取贮备液 用 20%甲 醇的 PBS(配制方法同 PBS T 不加吐温 20 即可) 稀释成制备标准曲线的所需浓度 4 仪器 所 有 玻 璃 器 皿 均 用 硫 酸 洗 液 浸 泡 用 自 来 水 .蒸 馏水冲洗 4.1 酶标检测仪 4.2 酶标极(40 孔或 96 孔) 4.3 电动振荡器 4.4 电热恒温水浴锅 无公害食品卫生标准 204.5 具 0.2mL 尾管的 10mL 小浓缩瓶 5 分析步骤 5.1 提取 称取 20g 粉碎并通过 20 目筛的样品 置 200mL 具塞锥形烧瓶中 加 8mL 水和 100mL 三氯甲烷 无 水乙醇(4 1) 密塞 振荡 1h 通 过 滤 纸
29、过 滤 取 25mL 滤液于蒸发皿中 置 90 水浴上通风挥干 用50mL 石油醚分次溶解蒸发皿中残渣 洗入 250mL 分 液漏斗中 再用 20mL 甲醇 水 (4 1)分次洗涤 转 入同一分液漏斗中 振 摇 1.5min 静 置 约 15min 收 下 层 甲 醇 水 提 取 液 过 层 析 柱 净 化 (层 析 柱 的 装 备 在层析柱下端与小管相连结处塞约 0.1g 脱 纸 棉 尽 量 塞 紧 先 装 入 0.5g 中 性 氧 化 铝 敲 平 表 面 再加入 0.4g 活性碳 敲紧) 将 过 柱 后 的 洗 脱 液 倒 入 蒸 发 皿 中 并 于 水 浴 锅 上浓缩至干 趁 热 加 3
30、mL 乙 酸 乙 酯 加 热 至 沸 挥 干 再重复一次 最后加 3mL 乙酸乙酯 冷至室温 后 转 入 浓 缩 瓶 中 用 适 量 乙 酸 乙 酯 洗 涤 蒸 发 皿 并 入浓缩瓶中 将 浓 缩 瓶 置 95 水 浴 锅 上 挥干冷却 后 用含 20%甲醇的 PBS 定容 供 ELISA 检测之用 5.2 ELISA 检测 无公害食品卫生标准 215.2.1 用 T 2 BSA(4g/mL)包被酶标板 每无公害食品卫生标准 22孔 100 L 4 过夜 5.2.2 酶 标 板 用 PBS T 洗 3 次 每次 3min 后 加入不同浓度的 T 2 标准溶液(制作标准曲线) 或 样 品 提 取
31、 液 (检 测 样 品 中 的 毒 素 含 量 )与 抗 体 溶 液 的混合液(1 1 每孔 100 L 该混合液应于使用的 前一天配好 4 过夜备用 ) 置 37 1h 5.2.3 酶标板洗 3 次 每次 3min 后 加入酶 标二抗 每孔 100 L 37 1.5h 5.2.4 同 上 述 洗 涤 后 加 入 底 物 溶 液 每 孔100 L 37 30min 5.2.5 用 1mol/L 硫酸溶液终止反应 每孔 50 L 于 450nm 处测定吸光度值 6 计算 T 2 浓度(ng/g) C V1/V2 D 1/M 式 中 C-酶 标 板 上 所 测 得 的 T 2 毒 素 的 量 (n
32、g) 根据标准曲线求得 V1-样品提取液的体积 mL V2-滴加样液的体积 mL D-样液的总稀释倍数 M-样品质量 g 7 精密度 本 法 的 精 密 度 为 6.8 20.3 平 行 允 许 差 为 无公害食品卫生标准 234.7% 19.2% 第二篇 直接法8 原理 将 已 知 抗 原 吸 附 在 固 相 载 体 表 面 洗 除 未 吸 附 的抗原加 入 一 定 量 的 酶 标 记 抗 体 与 样 品 (含 有 抗 原 ) 提 取 液 的 混 合 液 竞 争 温 育 后 在 固 相 载 体 表 面 形 成 抗 原 抗体 酶 复 合 物 洗 除 多 余 部 分 加 入 酶 的 底 物 在
33、酶 的 催 化 作 用 下 底 物 发 生 降 解 反 应 产 生 有 色 物 质 通 过 酶 标 检 测 仪 测 出 酶 底 物 的 降 解量 从而推知被测样品中的抗原量 9 试剂 本 标 准 所 用 试 剂 凡 未 指 明 规 格 者 均 为 分 析 纯 水为蒸馏水或同等纯度的水 9.1 甲醇 9.2 石油醚 9.3 三氯甲烷 9.4 无水乙醇 9.5 乙酸乙酯 9.6 二甲基甲酰胺 9.7 四甲基联苯胺(TMB) 9.8 吐温 20 9.9 30%过氧化氢(30%H2O2) 无公害食品卫生标准 249.10 抗 T 2 毒素单克隆抗体与辣根过氧化酶 结合物 9.11 抗原 T 2 毒 素
34、 与 载 体 蛋 白 牛血清白 蛋白的结合物(T 2 BSA) 9.12 ELISA 缓冲液系统 9.12.1 包 被 缓 冲 液 为 pH9.6 的 碳 酸 盐 缓 冲 液 称取 1.59g 碳 酸 钠 (Na2CO3) 2.93g 碳酸氢钠 (NaHCO3) 加水稀释至 1000mL 9.12.2 洗液为含 0.05%吐温 20 的 pH7.4 的 磷酸盐缓冲液(简称为 PBS T)配制方法为 称 取 磷 酸 二 氢 钾 (KH2PO4)0.2g 磷 酸 氢 二 钠 (Na2HPO4 12H2O)2.9g 氯 化 钠 (NaCl)8.0g 氯 化 钾(KCl)0.2g 吐温 20 0.5m
35、L 加水至 1000mL 9.12.3 底 物 缓 冲 液 为 pH5.0 的磷酸 柠檬酸 缓冲液 配制方法为 0.1mol/L 柠檬酸(C6H8O7 H2O) 即称取柠檬酸19.2g 加水至 1000mL 为甲液 0.2mol/L 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 即称取磷酸氢 二钠 71.7g 加水至 1000mL 为乙液 取甲液 24.3mL 乙液 25.7mL 加水至 100mL 即可 9.12.4 底物溶液 取 50 L TMB(10mg TMB 溶无公害食品卫生标准 25于1mL 二甲基甲酸胺中)溶液 10mL 底物缓冲液 10 L30%过氧化氢 混均 9.13 T 2 毒素标准溶液
36、用甲醇配成 1 mg/mL T 2 毒 素 贮 备 液 20冰箱贮存 于检测当天 精密吸取贮备液 用 20%甲 醇的 PBS(配制方法同 PBS T 不加吐温 20 即可) 稀释成制备标准曲线的所需浓度 10 仪器 所 有 玻 璃 器 皿 均 用 硫 酸 洗 液 浸 泡 用 自 来 水 .蒸 馏水冲洗 10.1 酶标检测仪 10.2 酶标板(40 孔或 96 孔) 10.3 电动振荡器 10.4 电热恒温水浴锅 10.5 具 0.2mL 尾管的 10mL 小浓缩瓶 11 分析步骤 11.1 提取 称取 20g 粉碎并通过 20 目筛的样品 置 200mL 具塞锥形烧瓶中 加 8mL 水和 10
37、0mL 三氯甲烷 无 水乙醇(4 1) 密塞 振荡 1h 通 过 滤 纸 过 滤 取 25mL 滤液于蒸发皿中 置 90 水浴上通风挥干 用50mL 石油醚分次溶解蒸发皿中残渣 洗入 250mL 分无公害食品卫生标准 26液漏斗中 再用 20mL 甲醇 水 (4 1)分次洗涤 转 入同一分液漏斗中 振 摇 1.5min 静 置 约 15min 收 下 层 甲 醇 水 提 取 液 过 层 析 柱 净 化 (层 析 柱 的 装 备 在层析柱下端与小管相连结处塞约 0.1g 脱 纸 棉 尽 量 塞 紧 先 装 入 0.5g 中 性 氧 化 铝 敲 平 表 面 再加入 0.4g 活性碳 敲紧) 将 过
38、 柱 后 的 洗 脱 液 倒 入 蒸 发 皿 中 并 于 水 浴 锅 上浓缩至干 趁 热 加 3mL 乙 酸 乙 酯 加 热 至 沸 挥 干 再重复一次 最后加 3mL 乙酸乙酯 冷至室温 后 转 入 浓 缩 瓶 中 用 适 量 乙 酸 乙 酯 洗 涤 蒸 发 皿 并 入浓缩瓶中 将 浓 缩 瓶 置 95 水 浴 锅 上 挥干冷却 后 用含 20%甲醇的 PBS 定容 供 ELISA 检测之用 11.2 ELISA 检测 11.2.1 用 T 2 BSA(4g/mL)包被酶标板 每孔 100 L 4过夜 11.2.2 酶标板用 PBS T 洗 3 次 每次 3min 后 加入不同浓度的 T 2 标准溶液(制作标准曲线) 或 样 品 提 取 液 (检 测 样 品 毒 素 含 量 )与 抗 体 酶 结 合 物溶液(1 100)的混合液(1 1 每孔 100 L 该混 合液应于使用的前一天配好 4 过 夜 备 用 ) 置 371.5h
