1、丹参 SRAP 反应体系的建立与优化第 25 卷第 1 期2008 年 2 月生物学杂志J0URNAL0FB10L0GYVo1.25No.1Feb,2008丹参 SRAP 反应体系的建立与优化李廷春,高正良,汤志顺(1.安徽省烟草研究所,安徽合肥 230031;2.安徽省凤阳县中医院安徽,凤阳 233100)摘要:相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新发展起来的分子标记技术.实验以丹参总 DNA 为模板,对 SRAPPCR 反应体系的重要参数设置梯度实验,筛选最佳的 SRAPPCR 反应条件.经过大量重复性实验,建立了一套适用于丹参稳定可靠,重复性好,带型清晰的 SRAPPCR 反应体系:25
2、L 的反应体系中,模板 DNA 量 40ng,2.5mmol/LMg“浓度,0,8Ixmol/L 的上下游引物,2001xmol/L 的 dNTPs 以及 Taq 酶 lu.研究结果表明,该体系可应用于丹参植物种质的分类鉴别,并为其地道性及功能基因的研究奠定基础.关键词:丹参;相关序列扩增多态性;分子标记中图分类号:Q503 文献标识码:A 文章编号:10089632(2008)O1004005丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltior 一Bunge)的干燥根及根茎 ,是中国沿用已久的传统中药之一,始载于神农本草经,被列为上品,本草纲目中也有相关记载.其根人药,性味苦,微寒,含丹
3、参酮,丹参素,丹酚酸等药效成分,为强壮性通经剂,有祛瘀,生新,活血,调经等多种功效.中医有“一味丹参饮 ,功同四物汤 “之说,其药用价值可见一斑.丹参的生态适应强,在中国广泛分布于华北,华东,中南,西北,西南部分省区也有分布.但因为过渡采挖,丹参的野生资源濒临枯竭,栽培品已经成为丹参的主要来源.近年来,对丹参的药理药效研究日趋深人,但关于丹参的种质分类鉴别及其亲缘关系的研究报道较少.目前,应用于丹参植物研究的分子标记仅有 RAPD 和 ITS 序列分析两种,“, 但 RAPD 技术稳定性差 ,扩增产率低;ITS序列分析测序资金成本高,耗费大.随着多种分子标记技术在其它药用植物研究中应用的日趋成
4、熟,势必可以找到一种适合于丹参植物并具备简便,高效,稳定可靠,产率高等优点的分子标记进行丹参种质分类鉴定和亲缘关系的研究.相关序列扩增多态性(SRAP,SequencerelatedAmplifiedPolymorphism)是由美国加州大学 Li 和 Quiros 于 2001 年发展起来的一种新型分子标记,该标记通过设计独特的上下游引物对 ORFs(OpenReadingsFrames)进行扩增.上游引物长 17bp,5 端的前 lObp是一段填充序列,紧接着是 CCGG,组成核心序列及 3端 3 个选择碱基,对外显子进行特异性扩增.下游引物长 18bp,5 端的前 11bp 是一段填充序
5、列,紧接着是AATT,组成核心序列及 3 端 3 个选择碱基,对内含子区域,启动子区域进行特异扩增.因不同个体,物种的内含子,启动子及间隔区长度不同而产生多态性.该标记具有简便,高效,产率高,高共显性,重复性好,易测序,便于克隆目标片段的特点,目前已成功地应用于作物遗传多样性分析,遗传图谱的构建等方面.本实验通过摸索丹参 SRAP 扩增反应体系的最优条件,为 SRAP 技术应用到丹参植物种质资源的鉴别及功能基因的研究奠定基础.l 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料供试丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)植株为安徽省烟草研究所选育的栽培种.1.1,2 试剂试剂:EDTA
6、,B 一巯基乙醇,CTAB,Tris,尿素等均购自美国 AMRESCO 公司;扩增引物,dNTPs,RNA 酶,Taq 酶均来自上海生工生物工程技术服务有限公司.试验中采用的引物序列见表 1.收稿日期:20070120;修回日期:20070706作者简介:李廷春(1981 一),男,主要从事药用植物及烟草组织培养技术,育种及植物分子生物学研究.基金项目:安徽省农科院重点及新兴学科培育项目“安徽省地道中药材资源利用研究“第 25 卷第 1 期2008 年 2 月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVo1.25No.1Feb,2008表 1 引物序列lablelSequencesofprim
7、ers注:lnl,m6,era3 和 era7 参照 Li.G 和 QuiresCF 报道的序列合成1.2 方法1.2.1 总 DNA 的提取采用 CTAB 法.提取丹参总 DNA.1.2.2DNA 增按 Li 和 Quiros 报道的扩增程序进行扩增,反应体系为 25L.根据有关文献报道和试验要求以随机组合 m6 一 era3 为引物对 DNA 扩增中的一些重要参数进行梯度设置,并严格控制其他参数和反应条件,确保试验的准确性和叮比性.1.2.3SRAP 扩增产物的电泳检测扩增产物与 6LoadingBuffer(40%蔗糖,0.25%溴酚蓝,0.25% 二甲苯青 FF)混匀后.用 6%聚丙烯
8、酰胺凝胶(7mol/L 尿素)电泳分析,电泳缓冲液为 lXTBE,.电泳时,先用 2000V 的电压预电泳30rain,上样后片 j2000V 电泳约 2h,至二甲苯青 FF为胶板 2/3 处.电泳后采用银染方法参照 Sanguinetti法.进行染色.2 结果与分析2.1 模板 DNA 片 j 量对 PCR 结果的影响试验中,在 25I 的反应体系巾依次设置了 10,20,30,40,50,80ng6 个模板 DNA 浓度梯度.从图 l 及表 2 可以看出,模板 DNA 的用量对于 PCR 的结果影响较大,当模板 DNA 的用量为小于 30ng 时,扩增 m 条带模糊不清晰;3080ng 时
9、,带型清晰且稳定;40ng 时的扩增效果最好,用量为最佳.表 2 模板 1)A 浓度对 PCR 的影响Table2EffecloftemplateconcentraliononPCR泳道模板 DNA/ng 结果泳道模板 DNA/ng 结果1l0+,/一 440+22O+/一 55O+33O+680+“+/一 “表示扩增产物小稳定.“+“表示扩增产物效率较高,“+“表示扩增产物效率高“+/一“:liableproduclofPCR,“+“:efficiemIn【1fI 【ji.1【lfPCR.“+“:llloreefficientproductofPCR(Sllleintable36)2.2 引
10、物浓度对 PCR 结果的影响引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会,所以试验中应选择以最低引物量产生所需要的结果为好.本试验在25I 的反应体系中将等量的上,下游引物(n6 一 era3)浓度分别设置为 0.4txmol/L,0.6txmol/L,0.8mol/L,1.0btrnol/L 四个浓度梯度进行 PCR 扩增反应.试验结果表明(见图 2 及表 4),引物浓度为 0.8txmol/L 时,扩增的条带最清晰,结果最好.表 3 引物浓度对 PCR 的影响Table3EffectofprimerconeentpationonPCR2.3Mg 浓度对 PCR 结
11、果的影响Mg 浓度是 PCR 反应中的一个重要 【大素.Mg浓度的变化可影响 SRAP 带型的相对强弱,它不仅会影响酶的活性及合成的忠实性,而且还会影向引物与模板的结合效率,模板与 PCR 产物的解链稳定性及产物的特异性和引物二聚体的形成等.试验中依次设置了:1.0HIH101/I,1.5mmol/L,2.0mmol/L,2.5retool/L,3.0mmoL/L,3.5mmol/L6 个 Mg“浓度梯度.图 3 及表 4 表明,Mg“浓度为小于 2.0mmoL/L 时,PCR 扩增的条带较少且弱;Mg 浓度为 2.53.Ommol/L 时,扩增的条带较多,带型清晰且稳定;Mg 浓度大于 3.
12、0mmol/L,带型稳定但有些弥散.表 4Mg.浓度对 PCR 的影响Fable4EffectofMg2concentrationonPCR泳道 M(g2+m浓l/度L结果泳道结果l1.0+/一 42.5+215+/一 53.0+32.0+63,5+/一2.4dNTPs 对 PCR 结果的影响表 5dNTPs 浓度对 PCR 的影响Table5Effectof(INTPsconcentrationonPCR泳道结果泳道嚣结果150+/一 4200+2lOO+/一 5250+3l5O+6300+/一dNTPs 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系.本试验依次设置了 6 个 dNTPs 浓度
13、梯度:50txmol/L,1O0txmol/L150txmol/L200txmol/L250txmol/L300txmol/L.图 4 及表 5 中的结果表明,dNTPs 的浓度4l第 25 卷第 1 期2008 年 2 月生物学杂志J0URNAL0FBIOLOGYVo1.25No.1Feb,2008过低或过高(50Ixmol/L,300tzmol/L)时,基本没有扩增产物;dNTPs 的浓度为 200IxmoL/L 的 dNTPs,得到的扩增效果最佳.图 1 不同 DNA 浓度的 SRAP 反应的结果注:M:marker16 分别为 10,20,30,40,50,80ngDNA/25LFig
14、1TheSRAPprofilewithdifferentDNAconcentrationsNote:M:marker16:10,20,30,40,50,80ngDNA/25L,respectively图 2 不同引物浓度的 SRAP 反应的结果注:14 引物浓度分别为 0.4,0.6,0.8,1.Omol/LFig2TheSRAPprofilewithdifferentprimerconcentrationsNote:14:primerconcentrationis0.4,0.6,0.8,1.0Ixmol/L,re spectively2.5Taq 酶对 PCR 的影响Taq 酶浓度太低,将导
15、致扩增效率降低;浓度过高,PCR 反应的稳定性降低,并会出现非特异性扩增42带,导致假阳性,甚至有时只出现亮的通带,而无任何扩增带.本试验在 25IxL 的反应体系中设置了 4 个浓度梯度的 Taq 酶用量:0.5U,1U,1.5U,2.0U. 从图 5及表 6 可以看出,Taq 酶用量为 1U 时,PCR 扩增的带型最为清晰稳定,扩增效果最好.图 3 不同 Mg 浓度的 SRAP 反应的结果注:16 表示 Mg 浓度分别为 1.0,1.5,2.0,2.5,3.0.3.5mmol/LFig3ThesSRAPprofilewithdifferentMg“concentrationsNote:14
16、:Mconcentrationis1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5mmol/L,respectively表 6Taq 酶浓度对 PCR 的影响Table6EffectofTaqpolymeraseconcentrationonPCR2.6 引物组合对 PCR 结果的影响本试验中的两组上下游引物 ml,m6,em3 和 em7为随机选取,并组合成 4 对上下游引物(如图 6)依次为 mlem3,mlem7,m6 一 em7,m6 一 em3,分另 0 对丹参总 DNA 进行扩增.试验结果表明:在 251xL 的反应体系中,在 40ng 模板 DNA 量,2.5mmol/LMg“浓度
17、,0.8ixmol/L 的上下游引物,200lxmol/L 的dNTPs 以及 Taq 酶为 1U 的条件下,4 种引物组合均能扩增出清晰可见,产率较高的条带,获得较好的扩增效果.3 结论与讨论通过对上述 PCR 反应条件中主要参数浓度筛选第 25 卷第 1 期2008 年 2 月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYV01.25N0.1Feb,2008的结果表明,适合于药用植物丹参 SRAP 最优的反应体系为:25pL 的反应体系中,模板 DNA 量 40ng,Mg浓度 2.5mmol/I,0.8txmol/L 的上下游引物,200txmol/L的 dNTPs 以及 Taq 酶 1U图
18、4 不同 dNTPs 浓度的 SRAP 反应的结果注:l 一 6dNTPs 浓度分别为 50,100,150,200,250,300txmol/1g4TheSRAPprofilewithdifferentdNTlseollcentratiollsNote:l6:dNTPseoncentrationis50,l00,l50,200,250300mol/L,respectively图 5 不同 Taq 酶用量的 SRAP 反应的结果注:14Taq 酶用量分别为 0.5,1.0,1.5,2.0UFig5TheSRAPprofilewithdifferentTaqDNApolymeraseseollc
19、elltrationsNote:l4:raqDNApolymoraseseOlleelltratlotlis0.5,1.0,l52.0U,respectively在利用 4 对引物组合 mlera3,mlera7,m6 一era7 和 m6 一 enl3 对丹参总 DNA 扩增的结果表明:4 对引物组合共检测出 126 个基因位点,平均每对引物产生 31.5 条带,图谱带型清晰,重现性好,稳定性高.说明该 SRAP 反应体系可直接用于丹参植物种质资源的鉴别分类和功能基因的研究.图 6 不同引物组合的 SRAP 反应的结果注:l4 分别为 mlran3,mlenff,m6 一 em7,m6 一
20、em3Fig6TheSRAPprofilewithdifferentmatchedprimersNote:l4:matchedprimersismlera3,mIem7,m6 一 em7,m6 一em3,respectively在 DNA 分子标记发展的历史上,用于药用植物分子鉴定的 DNA 标记已有 l0 多种.目前,应用较为广泛的分子标记技术主要有 RAPD,RFLP,SSR,AFLP 以及核酸序列分析等.而应用于丹参植物研究的分子标记仅有 RAPD 和 ITS 序列分析两种 ,如郭宝林,林生,冯毓秀,等用 RAPD 技术对 5 个省份 9 个主要居群丹参的遗传关系进行了初步研究,并就丹参
21、的地道性生产进行了探讨.汪红与王强采用 rDNAITS 序列分析研究了鼠尾草属 13 个类群的亲缘关系,并通过序列比较发现 ITS 序列信息位点丰富,不同种的鼠尾草属各类群均有多个特异性的单核苷酸变异位点,可以通过比较两段序列准确地鉴定每一种丹参药材.每一个分子标记技术在实际应用中都有其优,缺点.RAPD 技术虽操作简单 ,但稳定性差 ,扩增产率低;RFIP 在技术上要求严格,操作费力 ,成本高,多态性条带少;SSR 标记具有中等产率和产物大多为共显性标记的优点,然而该标记既费时又昂贵;AFLP 和ITS 序列分析在分子鉴别上的优点突出,但 AFLP 为43第 25 卷第 1 期2008 年
22、2 月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYV0l-25No.1Feb,2008显性标记,操作步骤繁琐,技术难度高,ITS 测序资金成本高,耗费大,且由于唇形科是一个高度进化的类群,ITS 序列分析仅仅反映了鼠尾草属植物遗传背景的一个方面,因此仅根据 ITS 序列研究鼠尾草属种系关系是不够全面的,还需结合其他 DNA 分析手段作出更准确的结论.SRAP 标记技术结合了 RAPD 和AFLP 二者的优点,该标记通过设计独特的上下游引物,对外显子,内含子区域,启动子区域进行特异性扩增,具有简便,稳定,中等产率,便于克隆,测序目标片段的特点.Li 和 Quiros在实验中还将 SRAP技术应用到 cDNA 的分析中,为采用 SRAP 技术在构建 cDNA 指纹图谱奠定了基础.此标记已在多种植物
