1、茚 三 酮 比 色 法 测 定 赖 氨 酸 含 量一. 目的了解赖氨酸总含量的测定方法。掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量。二. 原理蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的 e-NH2，它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色，在波长 570nm 处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系。亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同，它仅有的一个氨基（a-NH2）相当于蛋白质中赖氨酸残基上的 e-NH2，因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中赖氨酸的含量。但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比（赖氨酸与亮氨酸分子量之比为 1.11:1）。式中 W：样品质量C ：样品中游离氨基酸的量，各种作
2、物种子中游离氨基酸的含量大约是：玉米：0.01%，高粱：0.04%，水稻：0.01%，小麦：0.05%X ：从标准曲线查得的赖氨酸的质量三. 实验材料及设备1. 材料玉米粉2. 仪器分光光度计 分析天平 恒温水浴3. 器材刻度试管： 25mL11移 液 管： 1mL1 2mL2 20mL1 烧 杯： 250mL2 50mL1滴 管： 2洗 耳 球： 2滤 纸： f11cm研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各 1四. 试剂的配制1. 柠檬酸缓冲液（0.2mol/L，pH5.6）( 参见附录二)2. 茚三酮试剂称 3g 茚三酮溶于 100mL 95%乙醇中，溶解后加入 160mg 二氯化锡
3、，搅拌溶解后加入100mL 柠檬酸缓冲液中，搅匀备用。3. 亮氨酸标准液（50mg/mL）准确称取 5mg 亮氨酸，用蒸馏水稀释定容到 100mL，则得浓度为 50mg/mL 的标准液。五. 操作步骤1. 样品液的制备(1) 取材：称取烘干、粉碎（过 80 目筛）的玉米粉 0.3g（油料种子须经脱脂处理）。(2) 提取：将称取的样品放入试管，准确加入 20mL 蒸馏水，摇匀。读取样品悬液的总体积 mL，置于 80恒温水浴中提取 20min。（可间歇摇动）(3) 定容：冷却后，用蒸馏水将试管中悬液定容至（2）中悬液总体积刻度mL,，即最终样品液总定容体积仍为 20mL，摇匀。(4) 过滤：将提取液用滤纸过滤，收集滤液作为待测样( 滤纸不能用蒸馏水湿润)。2. 标准曲线制作及样品测定取 9 支刻度试管，按下表所示顺序操作。六. 结果处理1. 由 06 号管的数据，以亮氨酸含量(mg)为横坐标，A570 为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2. 求样品管 A570 的平均值 570；3. 由 530 从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量(mg)；4. 计算你所取生物材料中赖氨酸的含量（单位用 mg/mg 样重）。
