1、Comment y1: 以下红色字部分为修正过的1小远志醇提物抗蛇毒活性初探郁惠珍 1, 吴翚 2(1健雄职业技术学院，江苏 太仓 215411；2徐州师范大学化学系，江苏 徐州 221116)摘 要：通过比较小远志不同浓度乙醇提取物对眼镜蛇毒及蝮蛇毒中毒小鼠的保护作用来评价它们的抗蛇毒药效，发现 95%乙醇提取物具有最佳抗蛇毒药效；继续对 95%乙醇提取物的分段萃取部分（石油醚部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分）进行抗蛇毒活性筛选实验，发现乙酸乙酯萃取部分对中毒小鼠有较明显的保护作用。说明抗蛇毒活性成分可能是一种或多种中小极性物质，这为临床应用及有效成分的提取提供了依据，也减少了盲目性
2、。关键词：小远志；乙醇提取物；抗蛇毒活性中图分类号: R285.5 文献标识码: A 毒蛇咬伤属于突发的急性中毒事件之一。目前，世界上廉价蛇药供不应求，有着非常大的市场潜力，国内外对蛇药的研究极为关注 1-2。远志科植物小远志，性苦、微辛寒，分布云南 3-6。药理学研究表明其具有清热解毒、祛风止痛、拔毒、生肌的功能 4，入药可治疮疖痈肿、小儿支气管炎、肺炎、咽喉炎、扁桃体炎等各种炎症，胃痛、痢疾、跌打损伤、肋间神经痛等，对人体无毒，可内服或外用3。在云南民间，用食用白酒浸泡小远志出色后，可马上用于治疗毒蛇、毒虫咬伤以及鼠、猫等的咬伤，数小时至数天内外擦可以消肿、止痛、解毒、不留后遗症甚至不留疤
3、痕。可见小远志中含有较高的抗毒、消炎活性成分。目前有关小远志的研究报道很少 7-8 ，对于其抗蛇毒药理研究尚未见报道。基于小远志的药用价值，我们对它的抗蛇毒活性进行了初步研究。我们以乙醇为溶媒对其抗蛇毒有效部位进行提取，重点讨论最佳溶媒和有效部位的筛选，为临床应用及进一步进行活性分子的提取和分离提供依据。 小远志全草醇提物的抗蛇毒活性通过对眼镜蛇毒及腹蛇毒中毒小鼠的保护作用进行评价 9。1 小远志全草不同浓度醇提物抗蛇毒活性筛选Comment y2: 三线表最上下表线宜粗一些，取 1.5磅，下同 21.1 材料与方法1.1.1 试验材料动物：1825g 清洁级 ICR小白鼠 180只，由南京大
4、学生命科学院动物中心提供。小远志全草：采自云南明子山(海拔1 000 m) ,由云南省永善县中医院主任药师蔡大润鉴定(标本保存于云南省永善县中医院)。受试药物：眼镜蛇毒、腹蛇毒（购自福建武夷山蛇类研究所） ；95%、 75%、 55%、45%乙醇提取物的浸膏：取 4份小远志全草粗粉（20g/份） ，分别以 200mL4种浓度的乙醇浸泡 24 h，过滤，浓缩，得四份浸膏，分别为 2.95g、1.96 g、1.03 g、0.88g。1.1.2 小远志不同浓度醇提物对眼镜蛇毒中毒小鼠的保护作用取 75只 1825g的健康小白鼠，随机分为空白对照组、给药组（95% 、75%、55%、45% 乙醇浸膏组
5、） ，每组 15只编号。通过预试验，眼镜蛇毒皮下注射 1.5mg/ kg，24h 内小鼠死亡率可达 90%100%。因此，眼镜蛇毒对小鼠造模剂量定为1.5 mg/ kg，临用前以生理盐水为溶媒配制 0.04%的溶液。各给药组分别按 400 mg/ kg皮下注射不同浓度乙醇提取物的浸膏溶液（生理盐水配制） ，空白对照组给同体积生理盐水，20min后，小鼠皮下注射 0.04%的眼镜蛇毒 0.05mL/10g造模，观察各组小鼠 24 h内死亡率。1.1.3 小远志不同浓度醇提物对腹蛇毒中毒小鼠的保护作用取 75只 1825g的健康小白鼠，随机分为空白对照组、给药组（95% 、75%、55%、45%
6、乙醇浸膏组） ，每组 15只并依次编号。通过预试验，蝮蛇毒皮下注射 10 mg/ kg，24h 内小鼠死亡率可达 90%100%。因此，蝮蛇毒对小鼠造模剂量定为10mg/ kg，临用前以生理盐水为溶媒配制成 0.2%的溶液。各给药组分别按 400 mg/ kg皮下注射不同浓度乙醇提取物的浸膏溶液（生理盐水配制） ，空白对照组给同体积生理盐水，20min后，小鼠皮下注射 0.2%的蝮蛇毒 0.05mL/10g造模，观察各组 24 h内死亡率。1.2 实验结果表 1 不同浓度乙醇浸膏抗蛇毒活性筛选实验观察结果*乙醇浓度(%)浸膏剂量(mg/kg) 蛇毒种类 蛇毒剂量 (mg/kg) 动物数 (只)
7、 死亡数 (只) 局部症状- - 眼镜蛇 2 15 13伤口肿胀，2h 内因呼吸衰竭而死3* 本实验由南京大学生命科学院帮助完成。表 2 不同浓度浸膏抗蛇毒活性实验统计结果1.3 讨论：从实验结果可知： 95%乙醇提取得到的浸膏对眼镜蛇毒素和蝮蛇毒素的致死率较对照组均有明显下降，说明该浸膏中含有的抗蛇毒活性成分最多。不同浓度溶媒提取出的浸膏量随乙醇浓度降低而减少，说明小远志中所含小极性或非极性物质多于大极性物质，且具有较强抗蛇毒- - 眼镜蛇 1.5 15 1195 400 眼镜蛇 2 15 1095 400 眼镜蛇 1.5 15 275 400 眼镜蛇 1.5 15 655 400 眼镜蛇
8、1.5 15 1345 400 眼镜蛇 1.5 15 7- - 蝮蛇 10 15 1595 400 蝮蛇 10 15 1075 400 蝮蛇 10 15 1555 400 蝮蛇 10 15 1245 400 蝮蛇 10 15 15出血坏疽，肢全瘫，2.5h 内死于呼吸衰竭注射浸膏类别眼镜蛇毒素致死率(%)蝮蛇毒素致死率(%)对照（不注射浸膏）93.3 10095% 13.3 66.775% 40 10055% 86.7 8045% 46.7 1004活性的成分是一个或一些小极性或非极性分子。 浸膏对蛇毒的抑制能力没有规律，不随溶媒浓度的变化而呈递变规律。 各种浸膏对眼镜蛇毒素的抑制均强于对蝮蛇
9、毒素的抑制。眼镜蛇毒素和蝮蛇毒素虽然都属于混合毒素，但是眼镜蛇毒素主要表现为神经性毒素，而蝮蛇毒素主要表现为溶血毒素 9。初步推断小远志对神经性疾病可能有较好的疗效，如小儿惊厥、风湿等。2 对 95%乙醇提取浸膏的抗蛇毒活性研究由以上不同浓度乙醇提取物抗蛇毒活性筛选实验可得：95%乙醇提取浸膏具有最佳抗蛇毒药效。以下实验以 95%乙醇提取物为研究对象，对其不同极性溶剂的分段提取浸膏进行抗蛇毒筛选实验，找出其中药效最佳部分，为进一步提取分离提供依据。2.1 材料与方法2.1.1 实验材料动物：1825g 健康昆明种小鼠 120 只，由徐州医学院实验动物中心提供。受试药物： CMC-Na 溶液：白
10、色粉末，用蒸馏水配制成 0.5%溶液，作为对照组。 分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂，从 95%乙醇提取物的浸膏中萃取得到 4 份浸膏；将 4 份浸膏及总浸膏分别用 CMC-Na 配制成 40mg/mL 溶液，按400mg/kg 灌胃给药。 眼镜蛇毒：用蒸馏水配制成 0.2mg/mL 溶液，按 2mg/kg 皮下注射给药。2.1.2 实验方法取 1825g 小鼠 60 只，随机分成 6 组，每组 10 只。CMC-Na 溶液（0.5%）为对照组，灌胃给药 0.1mL/10g，其他给组按 400mg/kg（40mg/mL，0.1mL/10g ）灌胃给药。给药20min 后，按 2mg/
11、kg（0.2mg/mL，0.1mL/10g）皮下注射眼镜蛇毒。 48 h 内观察各组小鼠的死亡情况，统计各组的存活率。重复实验一次。2.2 实验结果表 3 各组浸膏灌胃的抗眼镜蛇毒实验结果*测试组 动物数 存活数(只) 致死率 (%)CMC-Na 组 10 0 100总浸膏组 10 7 30石油醚组 10 2 80Comment y3: P为何意，文中未交待Comment y4: 补全第三位作者名，第四位作者以后的用等代替，下同5氯仿组 10 4 60乙酸乙酯组 10 7 30正丁醇组 10 1 90* P0.05(与 CMC-Na组相比); 本实验由徐州医学院帮助完成。2.3 结论由表 3可
12、知：乙酸乙酯萃取部分具有与 95%乙醇提取物提取总浸膏相同的抗蛇毒活性；其次，氯仿萃取部分也表现出较明显的抗蛇毒活性，说明有效成分为中小极性化合物，并且乙酸乙酯萃取部分和氯仿萃取部分的有效成分可能有交叉。因此，我们下一步的工作重点是对这两个部分进行分离提取，以期望得到单分子的抗蛇毒有效成分，为研制一种高效蛇药作准备。参考文献：1蓝海, 李金荣, 胡征林. 蛇伤救治及研究中应注意的问题 J. 蛇志, 2005, 17(3): 176-180.2徐梅芳, 鲍炳和. 蝮蛇咬伤的中医与西医治疗比较J. 中国中西医结合杂志, 1996, 16(9): 543.3江苏新医学院. 中药大辞典( 上册)M.
13、上海: 上海科技出版社, 1985: 246.4陈书坤, 李恒, 陈邦余. 中国植物志M. 北京: 科学出版社, 1997, 43( 第 3分册)(8): 195.5中国科学院昆明植物研究所. 云南植物志M. 北京: 科学出版社, 1983, 3: 287.6韦群辉, 廖心荣等.滇南本草所载地丁的本草考证J. 云南中医学院学报, 1996, 19(3): 6-8.7吴翚, 周俊等. 小远志总多糖的微波提取及抗肿瘤活性研究J. 徐州师范大学学报(自然科学版), 2004, 22(3): 52-54.8郁惠珍, 吴翚, 杜百祥. 小远志全草醇提物弱极性组分化学成分的研究 J. 徐州师范大学学报(自
14、然科学版), 2005, 23(3): 71-74.9杨藻宸. 药理学和药物治疗学( 下册)M. 北京: 人民卫生出版社, 2000: 2161-2173.Studies on Anti-snake Venom Activity of Ethanol Extractfrom Polygala sibirica L.var megalopha Fr.YU Hu-izhen1 , WU hui2 6(1. Chien-Shiung Institute of Technology, Taicang 215411, China；2.Department of Chemist ry , Xuzhou N
15、ormal University , Xuzhou 221116 , China)Abstract:The anti-snake venom activity of extracts extracted by different concentrations of ethanol were evaluated by the effects on rats. The results indicated that the 95% ethanol extract had the strongest inhibition when it was used to treat both the nerve
16、 and the soluble blood snake venoms. Then, the activity of extracts of different solvents extracted from the 95% ethanol extract was examined on rats, too. It was found that the extract of acetyl acetate was the most available one. The results showed that the effective constituents were medium or low polar molecules. And it indicated the necessity of isolating the 95% ethanol extract.Key words: Polygala sibirica L. var megalopha Fr.; Ethanol extract; Anti-snake venom activity 作者简介: 郁惠珍(1979), 女, 江苏苏州人, 硕士,健雄职业技术学院化学工程系助教， 主要从事天然产物化学的研究。吴翚（1972），女，云南人，博士后，徐州师范大学化学系教师。
