1、热带作物学报2012，33(3)：427432 Chinese Journal of Tropical Crops 运用新方法鉴定木薯抗旱相关miRNA表达差异 杨蕊菊1,2，曾长英z，陈 新2，宋 顺 ，王 斌z，卢 诚z，彭 明z 1海南大学农学院海南海口 570228 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口 571101 3中国热带农业科学院海口实验站海南海口 570102 摘 要 为更加灵敏、高效地发现新miRNA并改进其表达差异鉴定方法，对木薯(Manihot e$culenta Crantz)SC124 和KU50这2个品种进行了驯化和非驯化2种干旱处理方式利用Muhipl
2、exed RTPCR法对2个木薯品种的8 个miRNA进行了表达差异研究。结果表明。8个miRNA具有明显的品种、组织和时序表达特异性，较为客观 真实地反映了miRNA的表达模式对胁迫信号的响应。因此，Multiplexed RTPCR法是一种快速、高效的分析 miRNA表达差异的方法在未来miRNA的研究中有着很好的应用前景。 关键词 木薯；miRNA；抗旱；Multiplexed RTPCR法；QPCR 中图分类号$8895 文献标识码 A New Method to Identify the Expression Differences of Cassava Droughtrelated
3、 miRNAs YANG Ruiju ，ZENG Changying ，CHEN Xin ，SONG Shun wANG Bin LU Cheng2,PENG Minf 1 College of Agronomy,Hainan University,Haikou，Hainan 570228，China 2 The Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou,Hainan 571101，China 3 Hkou Experim
4、ental Station，Chinese A cademy of Tropical Agricultural Sciences，Hkou,Hainan 570102，China Abstract Recent studies show that microRNA(miRNA)was expressed in plants induced by varieties stress Cassava，as a typical tropical energy crop，isolating from droughtrelated miRNAs may open new avenues for its g
5、enetic improvementIn order to discover new miRNAs more sensitively and efficiently and improve its identification methods，two cassava species(Manihot esculenta Crantz)SC124 and KU50 under two drought treatments(domesticated and non domesticated1 were used to study the differential expression of eigh
6、t miRNAs using Multiplexed RT-PCR methodThe results demonstrated that eight miRNAs had significant species，tissue and timing specificities which reflecting the expression patterns of miRNAs responsing to water-stress relative objective and authenticTherefore Multiplexed RT-PCR method is a rapid and
7、efficient method to analysis expression differences of miRNAs，which would have a promising prospect Key words Cassava；miRNA；Drought resisting；Multiplexed RT-PCR method；Q-PCR doi 1039690issn10002561201203007 miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的 具有调控功能的非编码RNA最近的研究表明 miRNA参与各种各样的调节途径 miRNA在控制 植物的发育、开花时序、新陈代谢、应激反应等方 面
8、均起着重要的作用【”。迄今为此对miRNA的检 测方法主要有：(1)Northern blot印迹闭，miRNA用 量大，对低丰度的miRNA检测效果不好；(2)茎环 引物PCR法，此法需要设计探针，耗时长：(3) miRNA芯片技术：微阵列的高通量有助于对 miRNA的大规模研究但它与Northern印迹同样 基于分子杂交的原理需要较大的样本量且假阳性 率较高【3-4因而得到的数据还需要经其他检测方 收稿日期： 基金项目： 作者简介： 法如实时定量PCR加以验证；(4)polrA聚合酶加 尾法 此法需poly(A)21尾且特异性较差。 miRNA定量检测方法的建立和发展主要集中 在综合利用各
9、种探针设计和标记技术结合微阵列 芯片、高通量测序、实时荧光定量PCR等技术来 提高检测通量、灵敏度和特异性 各种miRNA检 测方法的特点和灵敏度见表1 随着分子生物学新技术新方法的迅速发展科 研人员在定量检测miRNA方面有了更多的选择但 需要结合具体的实验目的和各种检测方法的优缺点 综合考虑以获得最经济和最优化的实验结果71 本研究采用Multiplexed RTPCR法对miRNA 20120214 修回日期：20120301 国家重点基础研究发展计划项目(No2010CB12660O)；国家自然科学基金(N031101193)中央级公益性科研院所基本科研业 务费专项(NoITYBB11
10、0103)。 (1985g-)，女，硕士研究生。研究方向：生物化学与分子生物学。通讯作者：彭明，E-mail：mmpeng_2000yahooeom。 一428一 热带作物学报 第33卷 进行表达量分析罔，与poly(A)聚合酶加尾法相比： (1)操作方便，省去了p0ly(A)加尾的步骤；(2)高 特异性：polv(A)聚合酶加尾法在进行反转录的过 程中使用的是polyT adapter引物Multiplexed RTPCR法使用特异的RT primer可对目标 miRNA进行特异反转录灵敏度由poly(A)聚合酶 加尾法的二碱基改进到Multiplexed RTPCR法的 单碱基；(3)灵敏
11、度：poly(A)聚合酶加尾法可检测 100 Pg总的RNA而Multiplexed RTPCR法可精 确lJlOPg总的RNA 1材料与方法 11材料 对木薯SC124和KU50进行干旱处理将所有 step 1Multolexed RT reaction miRNA molecules Step 2Separate realtinge 植株分为两部分：一部分直接进行干旱，另一部分 维持正常生长(DC：drought contro1)。将经过处理 的植株补水到生长含水量9O继续进行干旱处 理：驯化后旱害(DH：dmugh卜acclimation hurt)、非 驯化旱害(DNH：drought
12、 nonacclimation hurt)。另 外在进行第2次干旱处理过程中一直保留DC(正常 生长作为对照)在处理过程中采集功能叶和根。 12方法 121 多重RTPCR法的基本原理 Multiplexed RTPCR法的基本原理如图1所示 本试验中设计 的miRNA引物在进行qPCR扩增后产物大小为 50bp左右9。 122 引物设计 (1)序列获得。miRNA序列： 保守miRNA从植物的miRNA数据库下载(http： Forward primer拌1 Reverse primer#1 Pool of miRNA-specific RT primers with unique tags
13、 Reverse primer#N Forward primer#N 图1一种基于PCR技术的miRNA定量分析方法 第3期 杨蕊菊等：运用新方法鉴定木薯抗旱相关miRNA表达差异 一429一 wwwmirbaseorg)成熟序列与蓖麻基因组比对获 得蓖麻miRNA序列：木薯miRNA从木薯抗旱样品 Solexa测序获得 8个miRNA名称及成熟序列如 表2 独特标签序列和随机序列：来自Wang等 的研究。(2)同源性比较。将独特标签序列和随机 序列与木薯基因组序列进行同源性比对 经过与木 薯CDS序列比对未发现同源序列因此这些独 特标签序列和随机序列可被用于木薯miRNA的RT_ PCR引物
14、设计。(3)引物设计筛选。应用OMIGA软 件进行引物筛选( 值、引物自身二级结构、引物 之间二级结构等)。RT(reverse transcription)引物： 独特标签序列加miRNA的反向互补特异序列 PCR 引物：Forward primer：独特标签序列(22 bp)； Reverse primer：随机序列(411 bp)加miRNA的 正向特异序列(2122 bp)。内参基因选用U6，根 据其它物种中的17个U6基因的保守区序列设计 了木薯中U6的Forward primer和Reverse primer 其qPCR产物大小为50 bp。 表2 8个miRNA名称及成熟序列 1
15、23 miRNA的提取 采用北京百泰克生物技术 有限公司(Bioteke Corporation，Beijing)的“miRNA 快速提取试剂盒(离心柱型)”。按照使用说明，提 取上述样品的miRNA 124 cDNA第一链的合成(采用20 L的体系) 采用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)进行逆转录合成第一链 cDNA。具体操作如下： 将015 ng miRNA；1 P00l 0f miRNA specific RT primer(025 pmoFL)；7 IxL RNase free water加入无RN
16、ase的离心管中(冰上操作)。 65，5 min(水浴)；离心，置冰上。 再加入4 5xreaction Buffer；1 RNase Inhibitor(20UtzL)；2 lxL dNTP mix(10mmoL)；1 L MMuLV Reverse Transcriptase(200 UhxL)于管内 混均，离心25，5 min；42 oC，1 h；70，5 min。 即得第一链cDNA，并置于一20一70保存。 125 实时荧光定量 采用宝生物公司的SYBR Premix Taq俐实时定量PCR试剂盒(DRR041)进行 RTPCR分析。定量程序如下：先8个循环的降落 PCR接着32个循
17、环的常规PCR。每次循环在退 火步骤采集各管的荧光信号 每个样品均对miRNA 基因和内参基因U6平行进行3次重复CT值用 Rotor-Gene6000软件17版本的 CT法转换成 相对表达量 2结果与分析 首先以U6为内参计算出28个样品中miRNA 的相对表达量再以对照DC样品(DC样品的表达 量记为0)中miRNA的相对表达量做为本底计算 出miRNA在干旱处理后的表达量 数值在一l到l 之间干旱胁迫处理材料和对照的表达量差异不显 著；数值l，干旱胁迫处理材料和对照的表达量 差异显著高于对照：数值一l。干旱胁迫处理材料 和对照的表达量差异显著低于对照 其中上调表达 记为U，下调表达记为D
18、，无显著变化记为ND， 与阴性对照相比检测不到表达量则记为N(见表36)。 结果表明：该方法可以很好的将miRNA的表达量 动态变化显示出来(见表3-6) 8个miRNA的表达 模式在干旱胁迫诱导条件下的表达模式具有明显的 时序性(表3)和组织特异性(表4)，并且在同一处 理同一时间点的两个品种间(表5)和同一品种同一 时间点的不同处理间(表6)的表达模式亦具有显著 差异。 根据变化因素之间的表达量动态变化可以将 8个miRNA在2个品种、2种处理方式和2个时间 点的48个miRNA表达量数据进行分组 时序性的 表达模式可分为4类：4 d无显著差异到10 d上 调下调无显著差异不表达：4 d上
19、调表达到10 d 上调下调无显著差异不表达：4 d下调表达到 10 d上调下调无显著差异不表达：4 d不表达 到10 d无显著差异不表达。如：(1)miR4806982只 在SC124的根部DH处理下表达在KU50的任何 处理、任何部位中均不表达。(2)miR160a在2个品 种DH处理10 d时的功能叶和根中表达模式相似 均为根部上调表达但在DNH处理的4 d和10 d 的表达模式相反：SC124在DNH处理的4 d根中 上调表达，在KU50中下调表达：SC124在DNH处 理的10 d功能叶中上调表达，KU50下调表达。(3) miRNA157b在SC124和KU50这两个品种的表达 一4
20、30一 热带作物学报 第33卷 说明：样本编号代表“品种一处理一组织”，将miRNA在两个时间点的动态变化按照时间顺序记为“4 d表达模式一10 d表达模式”，两 个aCfl点的表达模式以“一”隔开。“一”表示4种表达类型：4 d无显著差异到10d上调，下调无显著差异，不表达；4 d上调表 达到10d上调下调，无显著差异，不表达；4d下调表达到10d上调，下调，无显著差异，不表达；4 d不表达到10 d无显著差异，不表达。 L：功能叶；R：根。下同。 表4 8个miRNA干旱胁迫诱导下表达模式的组织特异性差异 说明：样本编号代表“品种一处理一时间点”，将miRNA在功能叶和根的表达模式变化记为
21、“功能叶表达模式一根表达模式”，表达 模式记法同表2。 表5 8个miRNA干旱胁迫诱导下表达模式的品种间差异 说明：样本编号代表“处理一组织一时间点”。将miRNA在两个品种间表达模式的变化记为“SC124表达模式一KU50表达模式”，表达 模式记法同表2。 表6 8个miRNA在驯化与非驯化的干旱胁迫诱导表达模式差异 说明：样本编号代表“品种一组织一时间点”，将miRNA在两种不同干旱胁迫处理方式下的表达模式动态变化记为“DH表达模式一DNH 表达模式”，表达模式的记法同表2。 第3期 杨蕊菊等：运用新方法鉴定木薯抗旱相关miRNA表达差异 一431一 具有明显的品种间差异：除DNH处理的
22、叶片在4 d 和DNH处理的根在10 d的表达模式一致外其余 部位、处理和时间点表达模式均不一致。(4)DH和 DNH这两个处理在miR167c中除在SCl24根部4 d 表达模式一致均为上调之外在SC124和KU50 的其他时间点和其他部位均不一致(见表3-6)。 这4类差异表达的特异性显示了miRNA在木 薯干旱胁迫诱导中特有的表现：时序性的差异表 达可能与miRNA对胁迫信号响应的灵敏度的差 异有关：品种间表达模式的差异则可能与品种自身 的抗旱性强弱相关：而组织差异性表达则显示了干 旱胁迫诱导的条件下不同的组织行使不同的功 能：驯化与非驯化的处理条件的miRNA的差异性 表达为研究木薯在
23、干旱胁迫条件下的驯化效应的分 子机理提供了一定的依据 3讨论与结论 最近的研究结果表明植物在多种逆境胁迫下 存在着miRNA的诱导表达并证实了某些miRNA 在植物感受逆境胁迫而做出适应性调整的过程中发 挥着重要的作用。随着研究的深入miRNA将为 我们阐明植物耐胁迫机理和提高植物耐胁迫能力提 供重要的参考 本试验中的8个miRNA在木薯干旱 胁迫的2个时期及2种组织中有不同的表达模式 表明其在木薯抵御干旱胁迫中起重要的调控作用 31 miRNA的差异表达与表型 本研究中在2个品种DH和DNH 2种干旱胁 迫处理下miRNA的表达和受到干旱胁迫信号的 诱导而响应的miRNA的数目比未受到干旱胁
24、迫处 理的对照组的miRNA明显增多表明干旱处理确实 能够导致抗旱相关基因的差异表达 并且对miRNA 差异表达的组织特异性分析发现miRNA表达量 在根部变化比miRNA在功能叶中的表达量变化更 显著。而在胁迫过程中SC124和KU50的相比 SC124根部的干旱胁迫响应miRNA的数目及表达 量变化明显更多：胁迫处理第10天KU50很多根 都枯死而SC124长出许多新的须根 推测这些 miRNA的表达和新根的长出及抗旱能力之间有一定 的关系如差异表达显示的根部DH-IO d或者DNH- 10 d时的SC124与KU50存在差异表达的miR164d、 miR157b、miR4806982、m
25、iR160a、miR171ab和 miR5815094都有可能与老根的坏死和新根再生以 及抗旱能力相关 从2个品种DH和DNH的8个 miRNA的差异表达来看miRNA在DH处理中比 DNH处理中响应胁迫信号诱导的miRNA的数量更 多。其表达量变化更明显这有可能是植株在受到 干旱胁迫的驯化后再进行干旱时响应miRNA 会对胁迫信号敏感程度更高调节生理生化反应应 对胁迫更迅速从而会有更强的抗旱能力。 32 miRNA在其它作物中的功能 miRNA是近几年分子生物学的研究热点之一 其在动植物生命活动中的精细调控机制得到了众多 科学家的重视。本研究所检测的8个木薯miRNA中 在其他作物miRNA
26、的研究中，也有相关报道。刘 涵华等【m】在拟南芥中发现：miR167受干旱处理的 诱导。对miRNA基因上游l 000bp的启动子序列进 行分析发现在所分离这些胁迫诱导miRNA启动子区 域存在顺式胁迫响应元件如ABREs(ABAresponse elements)、AREs(anaerobic induction lements)、MBS (MYB binding Site involved in drought-inducibility)、 HSEs(heat stress responsive elements)、LTPs(1OW- temperature responsive elem
27、ents 和TC-richrepeat (dense and stress responsive elements)。这个结 果进一步证明了这些miRNA可能参与了植物某些 重要的胁迫响应过程。陈洁等【n在拟南芥中发现： miRNA160和miRNA164分别通过靶向生长素响 应因子(ARF)和NAC1转录因子来影响拟南芥根系 的发育。miR156、miR160、miR164和miR170171 分别具有花器官和花期的鉴定、植物生长激素信号 和根的发生、控制分生组织器官发生和花瓣数量、 反馈调节小RNA途径的生物学功能【 在本研究 中。这几个miRNA受到干旱胁迫信号的诱导而产 生表达量变化表
28、明这几个miRNA参与到了胁迫 信号响应机制中与木薯的抗旱分子机制有关为 今后研究这些miRNA对木薯抗旱分子机制的精细 调控功能具有重要参考价值 33 多重RTPCR法 miRNA做为一种重要的基因表达调控手段 参与各种生物活动，和控制多种疾病的发生发展。 miRNA对基因组的稳定、细胞通讯、信号传导及 生物和非生物胁迫中都起着至关重要的作用 其在 个体发育的不同时期及不同组织中有不同的表达模 式都表明了其在发育和分化中起有重大的调控作 用。其检测手段也越来越受到人们的重视各种各 样的检测技术被运用到miRNA的检测之中但是 无论界面检测技术还是均相检测技术存在自身优 点的同时或多或少存在不
29、足131 本试验采用了多重RTPCR法对miRNA进行 表达差异分析 Muhiplexed RTPCR法最大的特 点就是取消了通用的正向和反向qPCR引物使每 432 热带作物学报 第33卷 个miRNA都具有特异的逆转录引物和cPCR的正 反向引物。利用RT引物库进行逆转录一次反 转录即可满足若干个甚至数百个miRNA定量PCR 的模板所需，提高了实验效率，节约了成本 每个 miRNA。都设计了一套特异的引物用于检测实现 了只对特定模板的特定扩增 同时减少了假阳 性还可以通过设置不同反向引物解决区分同一家 族内不同成员表达量的问题 此外对于微量或高 度降解的miRNA也可通过此方法来进行检测
30、 本研究表明：多重RT法的实验操作简便，是 一种高灵敏度，高通量，高选择性，高特异性的检 测技术 该方法可以很好的显示出miRNA的表达 量的变化为进一步研究miRNA的功能提供了强 有力的证据其在将来的miRNA的研究中必定有 着广泛的应用前景 参考文献 【1张松莲，曾富华，喻宁华，等植物miRNA的功能及其作用 机制J】热带亚热带植物学报，2006，14(5)：444450 2】Lagos，Quintana M，Rauhut R，et a1Identification of novel genes coding for small expressed RNAsJScience，2001，2
31、94 (5 543)：853858 【3Hammond S MRNAi，microRNAs，and human diseaseJ Cancer Chemother Pharmacol，2006，58(Suppl 1)：s63-s68 I4】Lju C G，Calin G A，Croce C M，et An oligonucleotide microchip for genomewide microRNA profiling in human and mouse tissuesJProc Natl Acad Sci USA，2004，101(26)： 9 740-9744 5】Zeng C Y，
32、Wang W Q，Zheng Y，et o1Conservation and divergence of microRNAs and their functions in Euphorbiaceous plantsJNucleic Acids Research，2009(38)：981995 【66 Rui S，Vincent L，ChiangFacile means for quantifying microRNA expression by real-time PCRlJ1Biotechniques，2005 (39)：519-525 【7景花，宋沁馨，周国华MicroRNA定量检测方法的
33、研究进 展J_遗传，2010，32(1)：3140 【8Shi R，Chiang V LFacile means for quantifying microRNA expression by realtime PCRJBiotechniques，2005，39(4)： 5 19525 【9Wang X WA PCRbased platform for microRNA expression profiling studiesJRNA，2009(15)：7 16-723 10刘涵华，田鑫，吴长艾，等拟南芥胁迫诱导microRNA的 分离及其功能研究【C日照：山东生物化学与分子生物学会 2009年
34、学术会议论文汇编2009 11陈洁，林海建，潘光堂，等利用深度测序技术检测玉米根 系和叶片中已知的microRNAsJ遗传，2010，32(11)： l 175-1 186 【121周殿明，蒋健晖miRNA检测技术进展【JlI化学传感器， 2010，30(3)：1421 【13】Yang T W，Xue L G，An L ZFunctional diversity of miRNA in plantsJPlant SCI，2007(172)：423-432 14陈新，曾长英，卢诚，等基于PCR技术的miRNA定量 检测方法Jl_中国生物工程杂志，2010，30(11)：8893 责任编辑：古小玲
