1、中国农业科学 2011,44(6):1247-1254 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.06.021 收稿日期： 2010-05-10；接受日期： 2010-08-07 基金项目：国家自然科学基金项目（30600454）、国家蜜蜂产业技术体系和公益性行业科研专项（NYCYTX-43） 联系方式：李飞雄，Tel：0591-87640197；E-mail：。通信作者李江红，Tel：0591-87640197；E-mail： 蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性 李飞雄1,2，李江红1，梁 勤1，陈大福1（1福建
2、农林大学蜂学学院，福州 350002；2重庆市合川区畜牧兽医局，重庆 401531） 摘要： 【目的】研究由蜜蜂球囊菌引起的真菌性疾病白垩病的侵染机制，以及蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的种类及其特性。 【方法】利用人工合成的培养基，在体外诱导蜜蜂球囊菌分泌胞外蛋白酶，用硫酸铵沉淀和透析，获得初酶液，利用相应的底物对酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶的活力进行测定。 【结果】蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶主要有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶 3 种，无弹性蛋白酶和胰蛋白酶。对这 3 种酶的最适温度、 pH 值以及热稳定性和酸碱稳定性进行了测定。 这 3 种胞外酶的最适反应温度都在 40
3、左右，最适 pH 为 7 左右，均不耐高温，热稳定性差，在中性的 pH 环境下比较稳定。 【结论】蜜蜂球囊菌可以分泌多种胞外蛋白酶，它们的最适 pH 和温度与蜜蜂消化道内的环境一致。 关键词： 蜜蜂; 球囊菌; 胞外蛋白酶; 酶活力 Characteristics of Ascospheare apis Extracellular Proteinase LI Fei-xiong1,2, LI Jiang-hong1, LIANG Qin1, CHEN Da-fu1(1College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry Universi
4、ty, Fuzhou 350002; 2Animal Husbandry and Veterinary Bureau, Chongqing 401531) Abstract： 【Objcetive】 The objective of the study is to research the extracellular proteinase of Ascospheare apis which plays a key role for the pathogen to infect honeybee. 【Mehtod】 The extracellular enzyme of A. apis was
5、induced, purified and concentrated from an artificial medium. Then different substrates were used to determine the activity of caseinase，azocaseinase，collagenase and elastase trypsin. 【Result】 The results showed that caseinase, azocaseinase and collagenase were secreted by A. apis. Moreover, the opt
6、imum reaction temperature of three extracellular pretenase was all around 40, the optimum pH was all around 7. They were stable in middle pH buffer system under low temperature but quickly lost their activity under high temperature. 【Conclusion】 Multiple extracellular proteinase could be secreted by
7、 A. apis. Their optimum temprature was around 40 and the optimum pH was around 7, which was coincident with the physiological parameter of bee larvae midgut. Key words: honeybee; Ascosphaera apis; extracellular protease; enzyme activity 0 引言 【研究意义】白垩病病原为蜜蜂球囊菌1-2，是一种主要危害蜜蜂幼虫的真菌性疾病，成虫一般不受此病的危害。蜜蜂球囊菌的致
8、病过程是：混杂在花粉、蜂蜜中的球囊菌孢子随哺育蜂的饲喂伴随食物进入蜜蜂幼虫体内，孢子在消化道内萌发，形成新生的菌丝，菌丝在消化道内不断生长，后突破蜜蜂幼虫的消化道，侵入蜜蜂的血腔内，菌丝进一步大量生长导致蜜蜂幼虫死亡，穿透蜜蜂幼虫体表的异性菌丝在体外生长并相遇形成包囊，内含大量黑褐色的孢子，使染病蜜蜂幼虫呈黑褐色3。部分蜜蜂幼虫感染的蜜蜂球囊菌为单一性别的孢子或菌丝，菌丝在穿透蜜蜂幼虫体表后不能形成孢子囊孢子而使虫体呈现白色。这些大量形1248 中 国 农 业 科 学 44卷 成的球囊菌孢子在体外有极强的抗逆性，可以在自然条件下存活十几年而不失活性。它们在蜂群内伴随着蜜蜂的清理行为、蜜蜂的交互
9、哺育行为而在群内不同个体之间很快传播。同时，由于蜜蜂的迷巢行为，雄蜂的无群界、转地放蜂等因素使得该疾病又可以在不同的蜂群、不同的蜂场以及在较大的地区范围内大规模迅速传播。染病的蜂群由于绝大多数的蜜蜂幼虫被感染，不能羽化出房，蜂群的蜜蜂数量不能及时得到补充，使得蜂群不能发展壮大，满足不了蜂产品采集和农作物授粉的需要，且蜜蜂白垩病的发生有逐年增加的趋势4-8，亟需寻找控制蜜蜂球囊菌的有效措施。【前人研究进展】为应对白垩病的危害，蜂农尝试改进蜜蜂的管理、使用化学杀菌剂、使用自然界中分离得到的抑菌物质等多种方法防治白垩病9-11。迄今为止这些措施的效果都不是十分明显。近些年来人们发现具有较强清除能力的
10、蜜蜂在抵抗白垩病方面具有一定的优势，实际养蜂生产中也逐步加强对具有卫生行为蜜蜂的筛选12-14。但白垩病的危害至今依然无法摆脱，时常间歇性或者局部爆发，影响养蜂生产。【本研究切入点】为寻找控制白垩病的方法，人们已经对蜜蜂白垩病的病原学、流行病学和基础生物学等进行了大量工作15-17，但至今对蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂的机理知之甚少。昆虫病原真菌侵染宿主的过程，一般伴随着多种胞外蛋白酶的分泌，降解宿主昆虫的体壁，以便于入侵。这些分泌到体外的胞外蛋白酶的种类和数量时常与病原微生物侵染能力或毒力大小有关18-22。蜜蜂中肠肠壁细胞分泌有一层围食膜，主要由几丁质和多种蛋白组分组成，用于帮助消化食物，保护肠壁细
11、胞以及阻止病原微生物的侵染23-24。蜜蜂球囊菌通过污染有孢子的食物进入蜜蜂消化道，在中肠内萌发，突破围食膜和肠壁细胞的障碍，进入体腔大量生长，这一过程离不开相关胞外蛋白酶对围食膜的破坏。但蜜蜂球囊菌具体的胞外蛋白酶种类、特性及生物学功能则少有工作涉及。【拟解决的关键问题】本研究利用人工合成培养基，在体外培养蜜蜂球囊菌，诱导球囊菌表达胞外酶，而后用硫酸铵沉淀并纯化分泌到胞外的蛋白酶，利用不同酶的底物检测这些胞外蛋白酶的种类，并对其基本的特性进行研究，以期为蜜蜂球囊菌的致病机理及胞外蛋白酶在侵染蜜蜂幼虫过程中的作用研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 蜜蜂球囊菌的分离和纯化 蜜蜂球囊菌采自福建
12、农林大学实验蜂场。具体的分离纯化培养过程如下：从蜂群中采集患白垩病的蜜蜂幼虫，用75%的酒精进行表面消毒，在超净工作台上，将患病蜜蜂幼虫切成1 mm3的小块，接种于马铃薯培养基上（马铃薯200 g煮沸30 min，取滤液，加蔗糖或葡萄糖20 g，琼脂20 g，水补至1 000 mL），每个培养皿接3个点，然后将其倒扣在30恒温培养箱内，进行培养，待球囊菌菌斑生长至直径为12 cm时，挑取生长的菌丝重新接种于新的马铃薯培养基上，进行第二轮的纯化培养。这样重复进行数轮，直至获得纯的蜜蜂球囊菌菌株，置于4备用。 1.2 液体合成培养基配制 为避免培养基中其它蛋白质成分对试验产生的影响，配置了一种人工
13、合成的培养基诱导蜜蜂球囊菌表达胞外蛋白酶，其配方为（按1 000 mL计算）：CuSO45H2O 0.001 g、CaCl20.25 g、ZnSO47H2O 0.01 g、MnSO44H2O 0.001 g、MgSO47H2O 1.00 g、FeSO47H2O 0.005 g、KNO31.00 g、KH2PO41.00 g、甲壳素4.0 g、NaH2PO41.00 g、L-天门冬氨酸4.00 g、NaCl 0.20 g、复合维生素0.01 g、去离子水1 000 mL。把上述药品加热溶解，调pH值为6.8，然后分装在10个200 mL的锥形瓶中（每瓶100 mL），塞上棉塞，并用牛皮纸封包，在
14、121条件下，高压灭菌30 min，灭菌完毕，放入冰箱中备用。 1.3 蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶粗酶液的制备与浓缩 挑取在马铃薯培养基上培养56 d生长旺盛的蜜蜂球囊菌，转接于上面的液体合成的培养基中，置于摇床中（30，90 r/min）进行培养，培养56 d，将收集好的培养菌液用滤纸过滤去除菌丝，收集滤液。每1 000 mL滤液中加入561 g硫酸铵盐析（使硫酸铵的终浓度为80%），4过夜沉淀，4、10 000 r/min离心30 min。收集沉淀，用10 mL蒸馏水溶解，放入透析袋中用蒸馏水过夜透析。透析后的酶液-20保存备用。 1.4 球囊菌胞外酶活力测定 1.4.1 酪蛋白酶活力的测定 将
15、25 L透析得到的酶液加至50 L pH 7.0、含1%酪蛋白的200 mmolL-1磷酸缓冲液中，35水浴30 min。然后加入100 L 400 mmolL-1三氯乙酸终止反应。过滤后，取50 L滤液，加入250 L 400 mmolL-1Na2CO3液和25 L Folin试剂，40水浴20 min。于波长680 nm处于测定光密度值（OD680）25，重复测定3次。OD680值反映了酶活力的大小。在此测定条件下，OD680nm每增加0.1 6期 李飞雄等：蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性 1249 即定义为1个酪蛋白酶活力单位（U）。 1.4.2 偶氮酪蛋白酶活力的测定 偶氮酪蛋白溶于0
16、.1 molL-1Tris-HCl（pH9.6）缓冲溶液中至10 gL-1；取50 L酶液加100 L上述底物溶液；混匀，于40保温30 min后，加150 L 10%（w/v）三氯乙酸终止酶反应。将反应混合物置于4冰箱中10 min后，过滤并取100 L滤液加100 L、0.4 molL-1的NaOH，在30 min内，于波长440 nm处于测定光密度值（OD440）26，重复测定3次。在此测定条件下, OD440nm每增加0. 1即为1个偶氮酪蛋白酶活力单位（U）。 1.4.3 胶原蛋白酶活力的测定 5 mg可溶性胶原蛋白溶于1 mL 0.1molL-1Tris-HCl（pH 7.0）缓冲
17、液，将0.5 L待测酶液加到上述缓冲液中，在37下孵育60 min。然后在离心机里12 000 r/min离心2 min。取10 L上清液，加到含50 L 1%（w/v）茚三酮，120 L甘油和20 L 0.5 molL-1柠檬酸（pH5.5）的溶液中。然后将其在沸水浴中加热12 min，冷却。充分混匀在1 h内570 nm下测定其吸光度27-28，重复测定3次。在此测定条件下, OD570nm每增加0. 1即定义为1个酪蛋白酶活力单位（U）。 1.4.4 弹性蛋白酶活力的测定 该法依据与染料偶联的不溶性底物被酶作用而溶解至水相，反应上清液的光密度反映底物被酶消化的程度来进行测定。具体如下：2
18、%（w/v）地衣红弹性蛋白混悬液1 mL，pH 7.4、0.2 mo1L-1硼酸缓冲液1 mL，适当稀释的酶液1 mL，37振荡反应20 min，加入pH 6.0、0.7 mo1L-1磷酸钠缓冲液3 mL终止反应，离心后上清液测590 nm光密度值，以1 mL无离子水替代酶液的反应系统为空白29，重复测定3次。在此测定条件下, OD590nm每增加0. 1即定义为1个酪蛋白酶活力单位（U）。1.4.5 胰蛋白酶活力的测定 以苯甲酰L-精氨酸乙酯（英文缩写为BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定。苯甲酰L-精氨酸乙酯在波长253 nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L-精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋
19、白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L-精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加30。具体方法为：取2个光程为1 cm的带盖石英比色杯，分别加入25预热过的2.8 mL底物溶液。向一只比色杯中加入0.2 mL 0.001 molL-1HCl，作为空白，校正仪器的253 nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2 mL待测酶液，立即混匀并记时，每0.5 min读数一次，共读34 min，重复测定3次。绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率，变化率的大小反映了酶活力。在此测定条件下, 该变化率每增加0. 01即定义为1个胰蛋白酶活力单位（U）。 1.4.6 胞
20、外蛋白酶特性的研究 对检测出来的胞外蛋白酶，将反应体系置于2570下测定其酶活力，得出各温度下的反应速度；通过将制备的酶液分别置于30、40、50、60和70下保温不同时间后，按正常条件测定酶活力，确定其热稳定性；将测定体系置于不同的pH缓冲体系下测定酶活力确定最适pH值；将制备的酶液置于不同的pH的缓冲液内在35下放置30 min，测定酶活力，确定其酸碱稳定性。以上各处理均重复3次，以所测数据按占最优条件下所测数据的百分数进行作图，分析各胞外酶在不同温度及pH值条件下的活力及稳定性等特性。 2 结果 2.1 胞外蛋白酶种类 利用不含任何蛋白组分的人工合成培养基，诱导蜜蜂球囊菌分泌胞外蛋白酶，
21、经硫酸铵沉淀和透析获得胞外酶的粗酶液，利用酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶的底物和相应的方法分别进行测定，结果显示蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶中含有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶，但没有弹性蛋白酶和胰蛋白酶。 2.2 胞外蛋白酶的特性 2.2.1 酪蛋白酶 经检测，酪蛋白酶的最高反应温度为45（图1-A）。该酶在40以下稳定性较好，保温2 h活力能保持在70 %以上，60保温10 min以上严重失活，70保温10 min以上活力几乎全部丧失（图1-B）。该蛋白酶的最高反应pH为7。pH在48，蛋白酶活力都可保持在60 %以上，pH在911范围内蛋白酶的活力在40 %以下（图
22、1-C）。该酶的酸碱稳定性在pH 410范围，35下保温30 min，酪蛋白酶的活力可保持在40 %以上，在pH 57范围内酪蛋白酶的稳定性保持较好，活力能达到80%以上（图1-D）。 2.2.2 偶酪蛋白酶 偶氮酪蛋白酶的最高反应温度为50（图2-A）。该酶在40以下保温2 h左右，酶的稳定性较好，活力能保持在70 %左右。而在50以上保温10 min以上活力丧失比较严重，70时，活力很快全部丧失（图2-B）。偶氮酪蛋白酶最高反应pH为6，在pH 49 范围内酶的活力可保持60 %以上（图2-C）。在pH 59范围内，35 1250 中 国 农 业 科 学 44卷 A：温度对酪蛋白酶活力的影
23、响；B：温度对酪蛋白酶稳定性的影响；C：pH对酪蛋白酶活力的影响；D：酪蛋白酶的pH稳定性 A: Effect of temperature on caseinase activity; B: Effect of temperature on caseinase stability; C: Effect of pH value on caseinase activity; D: Effect of pH value on caseinase activity 图 1 酪蛋白酶的特性 Fig. 1 Charateristics of caseinase A：温度对偶氮酪蛋白酶活力的影响；B：温度
24、对偶氮酪蛋白酶稳定性的影响；C：pH对偶氮酪蛋白酶活力的影响；D：偶氮酪蛋白酶的pH稳定性 A: Effect of temperature on azocaseinase activity; B: Effect of temperature on azocaseinase stability; C: Effect of pH value on azocaseinase activity; D: Effect of pH value on azocaseinase activity 图 2 偶氮酪蛋白酶的特性 Fig. 2 Charateristics of azocaseinase 6期 李
25、飞雄等：蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性 1251 下保温30 min，酪蛋白酶的活力能保持在70%左右，在其它pH值范围内，偶氮酪蛋白酶的活力损失很大（图2-D）。 2.2.3 胶原蛋白酶 胶原蛋白酶的最高反应温度为50（图3-A）。该酶在50下热稳定性较好，保温2 h，活力能保持在60%以上，而在更低的30时，保温2 h，活力几乎没有任何丧失，在70时保温10 min以上时，活力就几乎全部丧失（图3-B）。胶原蛋白酶的最高反应pH为8.0（图3-C）。其酸碱稳定性较好，在pH311范围内35保温30 min，活力均能保持在70%以上。其中在pH 69范围内35保温30 min，活力几乎没有丧
26、失（图3-D）。 A：温度对胶原蛋白酶活力的影响；B：温度对胶原蛋白酶稳定性的影响；C：pH对胶原蛋白酶活力的影响；D：胶原蛋白酶的pH稳定性 A: Effect of temperature on collagenase activity; B: Effect of temperature on collagenase stability; C: Effect of pH value on collagenase activity; D: Effect of pH value on collagenase activity 图 3 胶原蛋白酶的特性 Fig. 3 Charateristics
27、 of collagenase 3 讨论 微生物生长过程中会不断向体外分泌各种酶类，多数胞外酶主要用于降解基质中的营养成分，使之易于吸收，以利于自身的生长和繁殖，是其正常生命活动的组成部分。而各种病原微生物为提高自己的竞争能力，生长过程中还可以分泌一些与侵染性或致病性有关的胞外酶，帮助微生物突破各种宿主昆虫的保护屏障，利于自己的生长与繁衍31-33。 昆虫也有各种防御微生物侵染的结构和机制，主要为表皮和消化道。昆虫表皮和中肠内的围食膜均主要由几丁质和蛋白交联在一起，可以有效预防大多数的微生物的侵染。 蜜蜂球囊菌以孢子作为传染源在蜂群之间传播，孢子不能在蜜蜂的体表萌发，因而不能通过表皮侵染蜜蜂幼
28、虫，其侵染蜜蜂的途径主要是通过消化道完成的15。从消化道侵染昆虫的病原微生物一般都具有破坏围食膜的机制，主要是通过分泌能够破坏围食膜的几丁质酶和蛋白酶类来完成。几丁质酶能够降解围食膜的几丁质成分，而蛋白酶类能够降解围食膜上的蛋白组分，两者都能够破坏围食膜正常的结构与功能。失去围食膜保护的昆虫极易遭受病原微生物的侵染。1252 中 国 农 业 科 学 44卷 凡是能够增强这两类胞外酶表达量或活力的机制均可以增强病原微生物的侵染性和毒力34-35。但与蜜蜂球囊菌侵染能力相关的胞外酶的研究还没有系统开展。 蜜蜂球囊菌可以分泌10多种胞外酶，大多是其正常生长发育所必须的36-38。而与蜜蜂球囊菌致病性
29、有关的胞外酶则主要是几丁质酶和蛋白酶。为探究胞外酶在蜜蜂球囊菌侵染蜜蜂过程中的作用，笔者已经对蜜蜂球囊菌胞外几丁质酶的特性进行了研究39。本研究对蜜蜂球囊菌分泌的胞外蛋白酶进行了诱导，经过80%硫酸铵沉淀，4 10 000 r/min 30 min离心，透析袋透析。利用各种蛋白酶的底物进行检测，确定了蜜蜂球囊菌分泌的胞外蛋白酶中含有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶。蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶中也可能还含有其它的蛋白酶类，需要在以后的工作中进一步确认。 通过对蜜蜂球囊菌胞外酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶的基本特性如最适温度、pH及其热稳定性和酸碱稳定性的测定。发现这几种酶的最适反应温度均为40
30、左右，最适的pH范围均为7左右。几种胞外蛋白酶的热稳定性都不是很好，高温可以较快速度的使其失活。酸碱稳定性方面，这3种胞外酶均在pH为57的中性条件比较稳定，而在其它偏酸或偏碱的条件下酶活力损失较大。蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的这种特性是与其生物学特性相适应的，它们在侵染蜜蜂幼虫，在幼虫体内生长，蜂群内哺育区的温度基本都维持在34.5左右，而蜜蜂消化道内的酸碱环境也基本是中性。球囊菌胞外酶的这些特性是与其侵染蜜蜂幼虫消化道内的环境条件相适应的，是长期进化的结果。 人工培养基在微生物的生理代谢和胞外酶及特性方面的研究具有重要的作用。本研究在一般真菌营养需求的基础上发展了适合于培养蜜蜂球囊菌的人工培养基
31、，可以有效避免一般培养基中的蛋白等组分，极大地方便了蜜蜂球囊菌胞外酶的诱导、纯化和后续的鉴定工作。 本研究通过体外培养和人工诱导胞外蛋白酶的方法，对蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的种类及其特性进行了探讨。研究结果对了解蜜蜂球囊菌的种类及其特性以及蜜蜂幼虫受侵染的机理等方面具有积极作用。但是，这种在蜜蜂体外诱导的胞外酶可能与蜜蜂体内感染时分泌的胞外酶是不一样的。体外试验不一定能完全准确反映蜜蜂体内的真实情况，蜜蜂球囊菌在侵染蜜蜂幼虫的过程中具体涉及到哪些胞外酶及各种酶的作用 还需进一步研究。 4 结论 蜜蜂球囊菌经体外诱导表达胞外酶，经检测含有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶等多种的蛋白酶，进一步的最适
32、温度和pH研究表明它们具有与蜜蜂幼虫消化道内基本一致的特性，反映了蜜蜂球囊菌孢外蛋白酶适应蜜蜂幼虫体内环境的特点。 References 1 Spiltoir C F. Life cycle of Ascosphaera apis (Pericystis apis). American Journal of Botany, 1955, 42(6): 501-508. 2 Spiltoir C F, Olive L S. A reclassification of the genus pericystis Betts. Mycologia, 1955, 47(2): 238-244. 3 Hor
33、nitzky M. Literature Review of Chalkbrood, a Fungal Disease of Honeybees. Kingston: Rural Industries Research and Development Corporation, 2001: 1-17. 4 Wood M. Microbes help bees battle chalkbrood. Agricultural Research, 1998, 46(8): 16-17. 5 Zaghloul O A, Mourad A K, El Kady M B, Nemat F M, Morsy
34、M E. Assessment of losses in honey yield due to the chalkbrood disease, with reference to the determination of its economic injury levels in Egypt. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 2005, 70(4): 703-714. 6 Puerta F, Flores J M, Bustos M, Padilla F, Campano F. Chalkbrood
35、 development in honeybee brood under controlled conditions. Apidologie, 1994, 25: 540-546. 7 Heath L A F. Occurrence and distribution of chalk brood disease of honeybees. Bee World, 1985, 66(1): 9-15. 8 Kluser S, Peduzzi P. Global Pollinator Decline: a Literature Review. Geneva: United Nations Envir
36、onments Programe, DEWA/GRID- Europe, 2007: 1-12. 9 Davis C, Ward W. Control of Chalkbrood Disease with Natural Products: a Report for the RIRDC. Kingston: Rural Industries Research and Development Corporation, 2003: 1-23. 10 石培彰, 顾剑明, 陈纪涵. 蜜蜂白垩病在浙江发生情况调查及药物防治初探. 中国养蜂, 1992, 2: 2-3. Shi P Z, Gu J M,
37、Chen J H. Investigation of the occurrence of bee chalkbrood and chemical control in Zhejiang province. Apiculture of China, 1992, 2: 2-3. (in Chinese) 11 Liu T P. Ultrastructural changes in the spore and mycelia of Ascosphaera apis after treatment with benomyl (Benlate 50 W). Mycopathologia, 1991, 1
38、16: 23-28. 6期 李飞雄等：蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性 1253 12 Spivak M, Reuter G S. Resistance to American foulbrood disease by honey bee colonies Apis mellifera bred for hygienic behavior. Apidologie, 2001, 32: 555-565. 13 Lapidge K L, Oldroyd B P, Spivak M. Seven suggestive quantitative trait loci influence hygienic
39、 behavior of honey bees. Naturwissenschaften, 2002, 89: 565-568. 14 Spivak M, Gilliam M. Hygienic behaviour of honey bees and its application for control of brood diseases and varroa mites. Part I: Hygienic behaviour and resistance to American foulbrood. Bee World 79:124-134. Part II: Studies on hyg
40、ienic behaviour since the Rothenbuhler era. Bee World, 1998, 79: 169-186. 15 Aronstein K A, Murray K D. Chalkbrood disease in honey bees. Journal of Invertebrate Pathology, 2010, 103: S20-S29. 16 Qin X, Evans J D, Aronstein K A, Murray K D, Weinstock G M. Genome sequences of the honey bee pathogens
41、Paenibacillus larvae and Ascosphaera apis. Insect Molecular Biology, 2006, 15(5): 715-718. 17 Puerta F, Flores J M, Bustos M, Padilla F, Campano F. Chalkbrood development in honeybee brood under controlled conditions. Apidologie, 1994, 25: 540-546. 18 Pedrini N, Crespo R, Jurez M P. Biochemistry of
42、insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology: Part C Toxicology and Pharmacology, 2007, 146(1/2): 124-137. 19 Sheng J Z, An K, Deng C S, Li W J, Bao X M, Qiu D W. Cloning a cuticle-degrading serine protease gene with biologic control function from
43、Beauveria brongniartii and its expression in Escherichia coli. Current Microbiology, 2006, 53(2): 124-128. 20 Charnley A.K. Fungal pahtogens of insects: cuticle degrading enzymes and toxins. Advances in Botanical Research, 2003, 40: 241-321. 21 Lopez-Llorca L V, Carbonell T, Gomez-Vidal S. Degradati
44、on of insect cuticle by Paecilomyces farinosus proteases. Mycological Progress, 2002, 1(3): 249-256. 22 冯明光. 胞外蛋白酶和脂酶活性作为球孢白僵菌毒力指标的可靠性分析. 微生物学报, 1998, 38(6): 461-467. Feng M G. Reliability of extracellular protease and lipaseactivities of Beauveria bassiana isolates usedas their virulence indices. A
45、cta Microbiologica Sinica, 1998, 38(6): 461-467. (in Chinese) 23 Wang P, Granados R R. Observations on the presence of the peritrophic membrane in larval Trichoplusia ni and its role in limiting baculovirus infection. Journal of Invertebrate Pathology, 1998, 72(1): 57-62. 24 Lehane M J. Peritrophic
46、matrix structure and function. Annual Review of Entomology, 1997, 42: 525-550. 25 曾胤新, 蔡明宏, 陈 波, 何剑锋. 一株产蛋白酶南极耐冷细菌的筛选及研究. 生物技术，2000, 11(2): 17-19. Zeng Y X, Cai M H, Chen B, He J F. Isolation and study of a psychrotrophic bacterium producing protease from Antarctica. Biotechnology, 2000, 11(2): 17-1
47、9. (in Chinese) 26 魏玉西, 汪靖超, 程殿林, 徐永立. 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质. 应用与环境生物学报, 2002, 8(4): 414-418. Wei Y X, Wang J C, Cheng D L, Xu Y L. Purification and property of extracellular proteases from Vibrio anguillarum. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2002, 8(4): 414-418
48、. (in Chinese) 27 Kang S I, Jang Y B, Choi Y J, Kong J Y. Purification and properties of a collagenolytic protease produced by marine bacterium Vibrio vulnificus CYK279H. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2005, 10: 593-598. 28 刘丽莉，马美湖，余秀芳，王文涛. 胶原蛋白酶产生菌的筛选及酶的分离纯化. 生物工程学报, 2010, 26(2): 194-200
49、. Liu L L, Ma M H, Yu X F, Wang W T. Screening of collagenase-producing strain and purification of Bacillus cereus collagenase. Chinese Journal of Biotechnology, 2010, 26(2): 194-200. (in Chinese) 29 贺稚非, 陈宗道, 李洪军, 刘 鹭, 高兆建, 宫春波. 胞外弹性蛋白酶的理化特性及其影响因素. 食品与发酵工业, 2005, 31(4): 10-13. He Z F, Chen Z D, Li H J, Liu L, G
